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目的1、探索天然免疫刺激剂NOD2-TLR3配体协同刺激能否打破肝窦内皮细胞(LSEC)免疫耐受状态。2、研究LSEC在NOD2-TLR3介导的抗HBV免疫应答中的作用机制。方法1、尾静脉高压水注射(hydrodynamic injection,HI)p AAV/HBV1.2质粒进入C57BL/6小鼠体内,建立慢性HBV复制小鼠模型。2、HI方式将p SM2/HBV1.3质粒入C57BL/6小鼠体内,建立急性HBV复制小鼠模型,抗CD8免疫磁珠分离的方法分离脾细胞中CD8~+T细胞。3、抗CD-90.1磁珠免疫方法分离BALB/C小鼠na?ve T细胞。4、胶原酶灌注和抗CD146免疫磁珠分离的方法分离C57BL/6小鼠的na?ve LSEC。5、流式细胞术检测NOD2、TLR3配体单独或联合刺激LSEC诱导的BALB/C小鼠na?ve T细胞及急性HBV复制小鼠CD8~+T细胞的增殖及细胞因子(IL-2、IFN-γ)的分泌。6、NOD2、TLR3配体单独或联合刺激LSEC 20h后,加入HBs Ag、HBc Ag肽刺激20h,PBS洗涤抗原,再加入HBV抗原特异性T细胞共孵育,5天后收集T细胞,将T细胞用HI方式导入小鼠肝内,HI后第1、4、10、20、30、40、50天采血,分离血清,定量ECLIA检测血清中HBs Ag、HBe Ag,定量Real time-PCR检测血清中HBV DNA。7、用NOD2、TLR3配体单独或联合刺激LSEC 1h、6h、20h,1h后收集细胞Phosflow检测NF-k Bp65、MAPKp38磷酸化水平;6小时后,收集LSEC,抽提总m RNA,Real time RT-PCR方法检测LSEC内IL-6、IL-2、TNF-α、IL-10、TGF-β、IFN-β、IFN-γ、ISG15、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CXCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12 m RNA水平;20小时后,收集LSEC及细胞上清,流式细胞术检测LSEC表面分子:MHCⅡ、CD40、CD80、CD86、PD-L1、CD54、CD106。微量样本多指标流式蛋白定量检测(CBA(cytometric bead array))细胞上清中细胞因子(IL-6、TNF-α)。8、用Graphpad软件作图,SPSS18.0对数据进行统计学分析。结果1、NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC后并未诱导同种异型性T增殖及分泌IL-2、IFN-γ。2、NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC后并未诱导HBV抗原特异性T细胞的增殖,但可增强HBV抗原特异性CD8~+T细胞分泌IL-2及IFN-γ。3、NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC介导小鼠体内抗HBV效应。4、NOD2-TLR3配体协同刺激未明显增强LSEC内NF-k B p56和MAPK p38蛋白的磷酸化水平。5、NOD2-TLR3配体协同刺激上调LSEC内ISG15、IL-2、IL-6 m RNA表达水平及TNF-α、IL-6蛋白水平。6、NOD2-TLR3配体协同刺激上调LSEC内趋化因子CCL5、CCL8、CXCL9、CXCL10m RNA表达水平。7、NOD2-TLR3配体协同刺激上调LSEC表面共刺激分子CD86表达水平。结论1、NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC后,可介导LSEC由免疫耐受状态转变为免疫激活状态。2、LSEC在被NOD2-TLR3联合激活后,虽不能诱导增强HBV抗原特异性CD8~+T细胞及同种异型性T细胞的增殖,但可增强HBV抗原特异性CD8~+T细胞分泌细胞因子的能力。3、NOD2-TLR3配体联合刺激LSEC可诱导HBV抗原特异性T细胞介导小鼠体内抗HBV效应。本研究的创新点1本次实验显示NOD2-TLR3配体协同刺激可打破LSEC的免疫耐受状态。2初步阐明了NOD2-TLR3配体刺激激活LSEC的免疫状态的可能机制及LSEC介导的HBV抗原特异性T细胞应答情况。本研究的意义NOD2-TLR3协同刺激可诱导肝内主要抗原提呈细胞LSEC由免疫抑制状态转为免疫激活状态,进一步通过处于激活状态的LSEC来诱导增强抗HBV病毒T细胞免疫应答,为探索NOD2-TLR3配体作为肝内免疫调节剂及抗HBV免疫治疗新策略的研究提供理论依据。