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目的:原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。我国原发性肝癌的发生率和死亡率分别为第四位和第三位,五年生存率仅为18%。原发性肝癌主要的危险因素包括乙型或丙型病毒性肝炎、酒精和黄曲霉素等。典型的原发性肝癌病理生理学进展过程包括肝炎-肝硬化-肝癌三个主要阶段。原发性肝癌的病理类型分为肝细胞癌、胆管细胞癌和混合细胞癌,其中肝细胞癌是最主要的类型。肝细胞癌的基本治疗方式为根治性切除。由于其恶性程度很高,早期诊断困难,对放化疗等不敏感,术后肿瘤很容易复发、转移。近年来随着肝细胞癌相关的分子生物学机制的逐步阐明,基因治疗、分子靶向治疗以及免疫治疗等新兴治疗方式在抑制肝细胞癌复发、转移方面显示了较好的前景。microRNA作为肝细胞癌发生发展的重要机制之一受到了越来越多的关注。microRNA是内生性短链非编码RNA,主要在转录后水平通过促进mRNA降解和抑制mRNA翻译来调节靶基因的表达。一个microRNA可以靶向多个基因,一个基因也可以被多个microRNA靶向抑制,microRNA还可以被lncRNA和环状RNA等靶向抑制。lncRNA、环状RNA、microRNA和mRNA组成复杂的调控网络对各种信号通路的关键分子起到重要的调控作用。microRNA与细胞生长、分化、细胞周期、凋亡和代谢等一系列生物过程密切相关。microRNA表达异常还可以引起包括癌症和心血管疾病在内的多种疾病。多篇文献报道miR-23a-27a-24-2簇在肝细胞癌中表达异常增高,与肝细胞癌的复发、转移密切相关。miR-23a-3p是miR-23a-27a-24-2簇的重要组成分子,先前的研究表明miR-23a-3p可以促进肝细胞癌生长和转移,调节肝癌细胞的化学敏感性,还可以抑制肝癌细胞凋亡。但miR-23a-3p与肝细胞癌细胞周期之间是否存在调控关系尚不明确。原钙粘蛋白属于钙粘蛋白超家族的亚家族之一,功能尚不完全清楚。其表达由于基因突变和启动子甲基化等原因在乳腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、亨廷顿病和非小细胞肺癌等疾病中常常被沉默。原钙粘蛋白PCDH17属于抑癌基因,位于人类染色体13q21.1上。PCDH17在急性髓性白血病、喉部鳞状细胞癌、膀胱癌、肝细胞癌和胃癌等多种癌症中表达明显下调。PCDH17可以诱导肿瘤细胞凋亡和自噬,但在胃癌和结肠癌中常常被甲基化。在肝细胞癌中PCDH17表达沉默可以通过激活EGFR/MEK/ERK信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和转移。然而,PCDH17对肝细胞癌细胞周期的调节作用尚不明确。本研究检测了人类肝细胞癌和邻近正常肝组织中miR-23a-3p和PCDH17的表达水平。此外我们还通过一系列体外实验探究了肝细胞癌中miR-23a-3p与细胞周期、PCDH17与细胞周期以及miR-23a-3p与PCDH17的关系。miR-23a-3p是否通过PCDH17调控肝细胞癌细胞周期也得到了验证。最后,我们通过体内实验对miR-23a-3p与肿瘤生长的关系进行了探究。方法:(1)通过RT-qPCR和western blotting对人类肝细胞癌和邻近正常肝组织中miR-23a-3p和PCDH17的表达水平进行了检测,并通过线性回归分析了miR-23a-3p和PCDH17的相关性。(2)通过RT-qPCR检测了Hep3B,Huh-7和HepG2细胞系中miR-23a-3p的表达水平,筛选出Hep3B和HepG2用于后续实验。通过RT-qPCR检测了Hep3B转染miR-23a-3p mimics和HepG2转染miR-23a-3p inhibitor的效率。通过CCK-8细胞活性检测、流式细胞周期检测、EdU渗入S期细胞数量检测和western blotting等体外实验探究了miR-23a-3p对肝细胞癌细胞周期的调节关系。(3)通过CCK-8细胞活性检测和流式细胞周期检测等体外实验探究了PCDH17对肝细胞癌细胞周期的调节关系。(4)Hep3B转染miR-23a-3p mimics和HepG2转染miR-23a-3p inhibitor后,通过RT-qPCR和western blotting检测了PCDH17的表达水平。通过生物信息学分析预测了PCDH17 3’UTR中miR-23a-3p的特异性结合位点。最后通过双荧光素酶报告实验确认了miR-23a-3p和PCDH17的直接靶向关系。(5)分别对Hep3B和HepG2转染PCDH17 siRNA,NC siRNA,PCDH17过表达质粒或空载体,并通过western blotting检测了转染效率。对Hep3B共转染miR-23a-3p mimics或NC mimics和PCDH17过表达质粒或空载体。对HepG2共转染miR-23a-3p inhibitor或NC inhibitor和PCDH17 siRNA或NC siRNA。共转染后通过CCK-8细胞活性检测、流式细胞周期检测、EdU渗入S期细胞数量检测和western blotting等体外实验探究了miR-23a-3p是否通过靶向PCDH17来调节肝细胞癌细胞周期。(6)分别向裸鼠左侧腋窝皮下注射稳定转染pre-miR-23a的Hep3B细胞和稳定转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞,并测量肿瘤生长速率。处死裸鼠后,取肿瘤组织进行HE染色计算坏死、凋亡细胞的数量,并通过IHC染色进一步确认miR-23a-3p和PCDH17的靶向关系。结果:(1)与对照组相比,肝细胞癌组织中miR-23a-3p的表达水平明显上调,PCDH17 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调。miR-23a-3p与PCDH17 mRNA的水平负相关。(2)在Hep3B,Huh-7和HepG2细胞系中,Hep3B的miR-23a-3p表达水平最低,HepG2的miR-23a-3p表达水平最高。Hep3B细胞转染miR-23a-3p mimics后miR-23a-3p的水平明显增加,而HepG2细胞转染miR-23a-3p inhibitor后miR-23a-3p的水平明显降低,表明转染是有效的。CCK-8实验中,转染48 h和72 h后,Hep3B的活性明显增加,而HepG2的活性明显降低。流式细胞周期检测中,转染miR-23a-3p mimics后Hep3B S期的细胞数量明显增加,G1期的细胞数量明显减少。而miR-23a-3p inhibitor转染HepG2的结果与Hep3B相反。EdU渗入实验的结果与流式细胞周期的结果相似。western blotting检测中,转染miR-23a-3p mimics后Hep3B细胞内cyclin D1,cyclin E,CDK2,CDK4,p-p27和p-RB的水平明显上调,而p27的水平明显下调。而miR-23a-3p inhibitor转染HepG2的结果与Hep3B相反。但是,RB的表达水平都没有明显改变。(3)PCDH17 siRNA转染Hep3B Cell后,CCK-8实验中,细胞活性明显增加。流式细胞周期检测中,S期细胞比例明显增加,G1期细胞比例明显减少。HepG2的转染实验结果与之相反。(4)miR-23a-3p mimics降低PCDH17 mRNA和蛋白的水平而miR-23a-3p inhibitor增加PCDH17 mRNA和蛋白的水平。miR-23a-3p mimics和携带PCDH17野生型3’UTR的质粒共转染后,细胞荧光素酶活性明显降低,表明miR-23a-3p和PCDH17存在直接靶向关系。(5)转染PCDH17 siRNA后PCDH17的水平明显降低。相反地,转染PCDH17过表达质粒后PCDH17的水平明显增加。CCK-8实验中,与miR-23a-3p mimics+空载体组相比,miR-23a-3p mimics+PCDH17过表达明显使Hep3B的细胞活性降低。流式细胞周期检测中,miR-23a-3p mimics+PCDH17过表达组Hep3B的S期细胞数量明显减少。EdU渗入实验的结果与流式细胞周期的结果相似。western blotting检测中,转染miR-23a-3p mimics和PCDH17过表达质粒的Hep3B细胞Cyclin D1和cyclin E的表达水平明显下调。HepG2的转染实验结果都和Hep3B相反。(6)体内实验表明注入裸鼠皮下的稳转pre-miR-23a的Hep3B细胞的生长速率明显加快,而稳转miR-23a-3p sponge的HepG2细胞的生长速率明显降低。HE染色显示转染pre-miR-23a的Hep3B细胞生长密集,但转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞坏死和凋亡较多。IHC检测中,转染pre-miR-23a的Hep3B细胞PCDH17的水平明显降低,而转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞PCDH17的水平明显增加。结论:(1)肝细胞癌组织中miR-23a-3p的表达水平明显上调,PCDH17的表达水平明显下调,二者呈负相关。(2)miR-23a-3p可以促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化。(3)PCDH17可以抑制肝细胞癌G1/S细胞周期转化。(4)PCDH17为miR-23a-3p的直接靶基因。(5)miR-23a-3p通过靶向PCDH17促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化。(6)体内实验表明miR-23a-3p可以促进肝细胞癌生长。