【摘 要】
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背景:生殖细胞缺乏所致男性不育不仅是临床难题,也是影响人类社会和谐发展的焦点问题。国内外已启动组织工程替代治疗的相关研究。间充质干细胞（MSCs）作为优选的组织工程细胞,可经诱导分化为生殖样细胞。但面临分化率和分化程度不高的难题,从而限制了其临床应用。因此,寻找提高MSCs向生殖细胞系分化效率的方法,成为亟待解决的问题。PR域锌指蛋白Prdm14作为生殖细胞特化的关键因子,参与生殖细胞发育过程中抑
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背景:生殖细胞缺乏所致男性不育不仅是临床难题,也是影响人类社会和谐发展的焦点问题。国内外已启动组织工程替代治疗的相关研究。间充质干细胞（MSCs）作为优选的组织工程细胞,可经诱导分化为生殖样细胞。但面临分化率和分化程度不高的难题,从而限制了其临床应用。因此,寻找提高MSCs向生殖细胞系分化效率的方法,成为亟待解决的问题。PR域锌指蛋白Prdm14作为生殖细胞特化的关键因子,参与生殖细胞发育过程中抑制体细胞编程、早期生殖细胞表观修饰等过程,开启生殖细胞命运。结合文献理论及课题组前期研究基础,我们提出科学假设:Prdm14可实现间充质干细胞向生殖细胞特化。本研究将为MSCs应用于临床治疗男性不育,提供新的诊疗策略及科学的实验数据,具有重要的临床意义及社会价值。目的:研究Prdm14是否具有诱导MSCs向生殖样细胞分化的作用,探讨甲基化修饰在此过程中的作用。方法:1.Western blot检测胎儿骨髓来源的MSCs（C3H10T1/2）与睾丸组织中原始生殖细胞PGCs早期发育标志物Prdm1、Stella、Ap2γ（即Tfap2c）、Prdm14,迁移及迁移至生殖嵴标志物Nanos3、Dnd1、Vasa、Dazl、Mael等的表达。2.采用生殖细胞特化的关键因子Prdm14构建Tet on过表达慢病毒载体,感染细胞,嘌呤霉素筛选C3H10T1/2过表达Prdm14细胞株,经多西环素（Dox）诱导48h,分别采用RT-q PCR、Western blot检测Prdm14 m RNA及蛋白水平,鉴定过表达细胞株。3.Dox分别诱导0,2,4,6 d,碱性磷酸酶染色及活性测定,观察酶活性情况;Western blot及免疫荧光检测主要干性因子Sox2、Nanog、Oct4,PGCs标志物Prdm1、AP2γ、Stella、Nanos3、Dnd1、Dazl和Ddx4,减数分裂前标志物Stra8、Scp3随诱导时间的表达变化,同时检测视黄酸合成酶Aldh1a1、代谢酶Cyp26a1的表达情况。4.Dox分别诱导0,2,4,6 d,检测5m C、5hm C水平变化情况;Western blot及免疫荧光检测DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b及羟甲基转移酶Tet1、Tet2表达变化。5.基于下一代测序亚硫酸氢盐聚合酶链反应（next generation sequencing-based BSP）技术检测生殖系特异指标Dazl、Ddx4及Scp3启动子区甲基化水平。6.Western blot及免疫荧光检测组蛋白H3K9me2及H3K27me3水平变化情况。结果:1.C3H10T1/2与睾丸组织均低表达原始生殖细胞迁移前标志物Prdm1、Stella、Ap2γ、Prdm14（p>0.05）;而Nanos3、Dnd1、Vasa、Dazl、Mael等的表达水平在C3H10T1/2中则显著低于睾丸组织（p<0.05）。2.与对照组相比,C3H10T1/2细胞感染过表达Prdm14慢病毒载体经Dox诱导后,Prdm14 m RNA及蛋白水平明显增高（p<0.05）,细胞增殖能力增强（p<0.05）,碱性磷酸酶表达增加（p<0.05）;核心干性因子Sox2、Oct4、Nanog表达水平均显著升高（p<0.05）。3.PGCs早期发育标志物Prdm1、AP2γ、Stella从诱导第2天开始表达明显高于对照组（p<0.05）,而迁移及到达生殖嵴后标志物Nanos3、Dnd1、Dazl、Ddx4,减数分裂前标志物Stra8,Scp3则从诱导第4天表达才显著增加（p<0.05）,视黄酸合成酶Aldh1a1表达显著升高（p<0.05）,代谢酶Cyp26a1表达无显著变化。4.5m C水平在诱导Prdm14高表达后无显著改变（p>0.05）;Prdm14诱导初期,Dnmt1、Dnmt3a定位于细胞核,从第4天开始,部分细胞Dnmt1、Dnmt3a信号从细胞核消失,或者向细胞质转移,且表达量有所降低（p<0.05）,而Dnmt3b在诱导前后均主要位于细胞质,表达量无显著变化。5.5hm C在诱导第4天开始表达迅速上升（p<0.05）,随后降低;诱导Prdm14高表达后,羟甲基转移酶Tet1细胞核、细胞质均有表达,且表达量显著增加（p<0.05）,Tet2定位于细胞质,诱导前后其表达无明显变化。6.组蛋白H3K9me2从诱导第4天开始,表达降低（p<0.05）,H3K27me3经诱导后,其表达先升高（p<0.05）,随后降至诱导Prdm14高表达前。结论:1.Prdm14可促进C3H10T1/2细胞向生殖样细胞分化,且可分化至减数分裂前阶段。2.Prdm14可能通过DNA去甲基化作用及组蛋白修饰协同作用机制,促使C3H10T1/2细胞向生殖样细胞分化。
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