阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)俗称老年痴呆,在中医属于“痴呆”、“呆症”、“呆病”等范畴,是老年期痴呆病中最常见的类型之一。国内外流行病学和临床实验研究表明,随着中老年女性绝经后体内雌激素水平的下降,其患AD的风险和比率也将大大增加,且AD患者的认知障碍损害程度明显高于老年男性。如对围绝经期女性(特别是卵巢摘除术后的女性)给予雌激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)可大大降低AD的患病风险,改善AD患者的认知功能。尽管如此,但现在临床实践证明,长期应用雌激素的女性患者可增加患乳腺癌和子宫内膜癌的风险,因而对其是否适合使用及其使用时间备受争议。植物雌激素(Phytoestrogen)属于一类选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulators,SERMs),可选择性作用于某种雌激素受体,对不同组织或细胞产生不同的选择性调节作用,大量的基础、临床和流行病学研究表明,植物雌激素在动物和人身上发挥类似雌激素样的作用,能减轻更年期症状,并少有子宫内膜癌或乳腺癌的发生,从而克服HRT的治疗矛盾。生长激素(growth hormone,GH)与雌激素一样也是体内重要的内分泌激素之一,亦被证实可改善AD所致的记忆损害。GH与其受体二聚体结合,激活JAK2,促发一系列信号通路,其中JAK/STAT途径是最主要的信号途径。近年来,GH与雌激素的相互作用已被诸多实验证实,但两者对于神经系统的影响,目前研究甚少。本研究拟通过体内外实验观察植物雌激素鹰嘴豆芽素A(Biochanin A,Bio A)对大鼠海马神经元的作用,并探讨Bio A和GH在神经元细胞中如何相互影响。本研究分以下三部分展开:1.鹰嘴豆芽素a对去卵巢衰老大鼠学习记忆的影响取成年雌性wistar大鼠,无菌条件下行双侧卵巢摘除术,术后第八天做阴道涂片检查,连续观察5天,确定造模是否成功。实验分模型组、β-雌二醇组、bioa低、中、高剂量组。术后第4周开始给药,连续灌胃12周,实验过程监测大鼠体重。在实验结束的前一周左右,所有大鼠进行morris水迷宫实验,连续测试6天,判断各组大鼠的学习记忆能力。给药结束后,随机取每组2只大鼠行脑组织灌流固定,制作切片。光镜下he染色观察大鼠海马组织神经元细胞形态学变化;透射式电子显微镜下观察海马神经元包膜及细胞内部结构变化。每组剩余大鼠进行脑组织标本采集,左侧大脑制成10%脑组织匀浆,测定脑组织内mda含量和gsh-px、sod活性,探讨bioa抗氧化能力。右侧海马组织提取总蛋白,westernblot方法观察pparγ和mmp-2蛋白表达变化。另外取每组2只大鼠相同部位的子宫和乳腺组织,制作石蜡切片,he染色,镜下观察bioa对大鼠子宫和乳腺组织形态学有无影响,初步判断bioa对大鼠子宫、卵巢的安全性。研究结果发现,在实验过程中随着时间各组大鼠体重不断增加,其中模型组大鼠体重增长较为迅速。在给予bioa治疗的12周过程中,与模型组大鼠比较,给药大鼠体重增长趋势变缓。在morris水迷宫实验中,随着训练天数的增加,bioa各给药组及雌激素对照组的逃避潜伏期较模型组明显缩短(p<0.05);在空间探索实验中,bioa干预12周后,与模型组比较,大鼠穿越平台所在象限的次数增加,在目标象限留滞时间延长,特别是高剂量组差异明显(p<0.05)。光镜下观察大鼠海马组织,假手术组大鼠海马神经元细胞成行整齐排列,细胞形态规则,细胞无固缩或溶解。模型组大鼠大部分海马神经元胞体缩小固缩,胞浆深染,细胞排列较分散,细胞呈现凋亡或死亡。经bioa及e2干预治疗后,细胞坏死数量明显减少,病变得到不同程度的改善,其中bioa高剂量组变化最为明显。电镜下观察大鼠海马神经元细胞,正常细胞形态结构完整,细胞内线粒体结构清晰可见,峭膜完整;模型组胞膜部分溶解,线粒体结构不清,核仁固缩,核染色质大量边集于核膜内侧。bioa与e2干预治疗后,细胞形态结构得到不同程度改善,其中bioa高剂量组接近正常细胞。去卵巢大鼠脑组织匀浆中mda含量显著抬高,gsh-px、sod活性明显下降。bioa给药组可降低mda含量,升高gsh-px、sod活性,并呈现一定的剂量的依赖性。westernblot检测结果发现,与假手术组比较,模型组大鼠pparγ蛋白表达下调、mmp-2蛋白表达明显上调,bioa给药组可以上调pparγ、下调mmp-2蛋白表达,特别是高剂量组降低明显。he染色光镜下观察大鼠乳腺组织,去卵巢后的大鼠腺泡数量明显减少,腺管短而小,腺体呈萎缩状态,bioa低、中剂量组与模型组无显著性差异,腺体萎缩。但高剂量组腺泡数量明显增多,腺管呈囊性扩张,腺体增生明显。光镜下观察各组大鼠子宫,未见明显差异。2.鹰嘴豆芽素a对过氧化氢诱导大鼠原代海马神经元损伤的作用取新生24小时内大鼠海马神经元细胞,进行原代细胞培养,镜下观察细胞生长状态,培养10天左右,加入神经元特异性抗体map-2,荧光鉴定神经元细胞纯度。以不同浓度梯度的bioa(10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/l)或不同浓度梯度的h2o2(100、200、400、800μmol/l)刺激海马神经元24h,cck8法观察bioa对海马神经元细胞活力的影响。将培养的原代海马细胞分为正常组、h2o2组、bioa低中高三个剂量组,根据筛选出的bioa最佳作用浓度给予三个剂量组,药物作用24h后,除正常组外,其余组给予筛选出的h2o2最佳作用浓度造模12h,用cck8法观察bioa对h2o2诱导海马神经元细胞活力的影响;利用流式细胞术,观察bioa对海马神经元细胞凋亡和胞内活性氧(ros)的影响。提取细胞总蛋白,westernblot法测定bcl-2、bax、casepase-3蛋白表达水平。培养至第10d的海马神经元用神经元特异性抗体map-2荧光检测海马神经元纯度,结果显示,在荧光相差显微镜下,海马神经元胞体和突触呈现绿色荧光,细胞核呈现蓝色荧光,经鉴定,纯度可达98%以上。以不同浓度梯度的bioa或不同浓度梯度的h2o2刺激海马神经元24h,结果显示,bioa在10-7-10-4mol/l浓度范围内可以不同程度促进神经细胞的增值,其中在10-5mol/l浓度附近,增值作用最为显著。与正常对照组相比,100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、800μmol/lh2o2分别使细胞活力大约下降10%、20%、45%和89%,呈现明显的剂量依赖性。cck8法观察bioa对h2o2诱导海马神经元细胞活力的影响,结果显示,与h2o2组相比,bioa预处理组能显著抑制h2o2作用引起的海马神经元损伤,其中bioa高剂量组作用明显(p<0.05)。流式细胞术观察bioa对h2o2所致海马神经元ros的影响,结果显示,与正常对照组比较,h2o2组dcf荧光明显增强,提示细胞内ros水平升高,bioa处理组能明显降低细胞内ros水平(p﹤0.001)。流式细胞术观察bioa对h2o2所致海马神经元凋亡的影响,结果表明,正常对照组在收集过程中出现部分细胞损伤,有少许凋亡和坏死细胞存在。h2o2损伤后,凋亡细胞数和坏死细胞数明显增加,给予bioa预处理后,可明显减少h2o2引起的凋亡和坏死细胞数。westernblot方法观察bioa对海马细胞中bcl-2、bax和casepase-3蛋白表达的影响,结果所示,与正常对照组比较,模型组细胞bcl-2蛋白表达下调,bax、casepase-3蛋白表达上调;bioa作用后可剂量依赖性地上调模型细胞bcl-2蛋白表达,下调bax、casepase-3蛋白表达。3.鹰嘴豆芽素a对生长激素jak/stat信号通路的调控机制以不同浓度梯度的gh(5、25、125、250、500ng/ml)刺激海马神经元24h,cck8法观察gh对海马神经元细胞活力的影响。根据筛选出的bioa和gh的最佳作用浓度单独或联合作用海马神经元24h后,用cck8测定单独或联合用药对海马神经元细胞活力的影响,观察两药合用是否具有协同作用。选取不同浓度的gh(0.1、1、5、10、20ng/ml)或不同的作用时间(15、30、60、90min)刺激海马神经元细胞,提取细胞总蛋白,测定细胞中stat5和p-stat5蛋白的表达,筛选gh合适的作用浓度及作用时间。选取不同浓度的bioa(10-10、10-9、10-8、10-7mol/l)或不同的作用时间(15、30、60、90min)刺激海马神经元细胞,提取细胞总蛋白,测定细胞中socs2蛋白的表达,筛选bioa合适的作用浓度及作用时间。根据筛选出的bioa和gh的最佳作用浓度和作用时间单独或联合刺激海马神经元,提取细胞总蛋白,测定细胞中stat5、p-stat5和socs2蛋白的表达。以10-8mol/lbioa作用海马神经元60min,运用rt-pcr和westernblot方法测定细胞中socs1、socs2、socs3mrna和蛋白的表达。以不同浓度gh(5、25、125、250、500ng/ml)作用海马神经元细胞,24h后测定细胞活力。结果显示,gh在5-250ng/ml浓度范围内对细胞无毒性,其中在125ng/ml浓度附近,对海马神经元有一定的促增值作用,浓度再大,药物开始出现细胞毒性,细胞活力下降。以125ng/mlgh和10-5mol/lbioa单独或联合刺激海马神经元,24h后测定细胞活力。结果显示,合用药比单用药更能促进海马神经元细胞增殖,根据金正均法计算q>1.15,提示两药合用具有协同作用。运用westernblot方法测定不同浓度、不同时间的gh刺激海马神经元后stat5和p-stat5的蛋白表达或测定不同浓度、不同时间的bioa刺激海马神经元后socs2的蛋白表达,结果显示,gh在5ng/ml,作用60min时,细胞stat5和p-stat5蛋白的表达差异最明显,遂确定gh的作用浓度和作用时间。bioa在10-8mol/l,作用60min时,细胞socs2蛋白的表达差异最明显,遂确定bioa的作用浓度和作用时间。以10-8mol/lbioa和5ng/mlgh单独或联合作用海马神经元60min,Western Blot方法测定STAT5、P-STAT5和SOCS2蛋白表达。结果显示,Bio A和GH联合给药可明显增加STAT5、P-STAT5蛋白表达水平,尤其是Bio A比GH提前60min处理给药比同时给药更能引起STAT5、P-STAT5蛋白表达水平的上调(p<0.001);能够下调SOCS2蛋白表达水平(p<0.05)。以10-8mol/L Bio A作用海马神经元细胞60min后,提取细胞RNA和总蛋白,测定SOCS1、SOCS2、SOCS3 mRNA和蛋白的表达水平。结果显示,与对照组比较,SOCS1、SOCS2、SOCS3 mRNA基本变化不大,SOCS2蛋白表达明显下调(p<0.001),而对SOCS1和SOCS3蛋白表达无影响。通过上述实验,我们证实Bio A对大鼠海马神经元的损伤具有保护作用,其机制可能与抗氧化与抗凋亡机制有关。Bio A在较大剂量范围内对乳腺和子宫无影响,超过一定剂量可刺激大鼠乳腺组织的增生。Bio A和GH在一定剂量范围内可促进海马神经元细胞增殖,两者合用可发挥协同作用。Bio A可增强GH活化STAT5的程度,其作用与下调细胞因子信号传导抑制因子SOCS2蛋白表达,促进生长激素JAK/STAT5信号通路有关。