维生素D3(VD3)是一种作用于钙、磷代谢的激素前体,具有广泛的生理活性,参与多种生理活动,是一种重要的小分子化合物。传统化学法合成维生素D3步骤多,反应得率低,且合成过程环境污染较为严重。随着代谢工程及合成生物学技术的快速发展,酿酒酵母细胞因其具有较高的同源效率及成熟的分子操作工具,已成为萜类化合物从头合成的经典宿主细胞。本研究利用代谢工程技术改造酵母麦角甾醇合成途径,生产维生素D3前体胆甾-5,7,24-三烯醇。在经典的酿酒酵母麦角固醇合成代谢中,通过敲除角鲨烯形成步骤有关的ERG5和ERG6基因,将终产物麦角固醇转变为胆固醇合成前体,并进一步通过筛选及过表达关键限速酶,提高目的产物胆甾-5,7,24-三烯醇的累积量。实验结果表明,ERG6基因的单敲除细胞酵母甾醇和胆甾-5,7,24-三烯醇的含量得到显著累积;ERG5基因的单敲除细胞麦角甾-5,7-二烯醇(Δerg5)显著累积,在ERG6/ERG6双敲除细胞中目的产物胆甾-5,7,24-三烯醇累积量显著提升,相较于野生的BY4741下表,上述细胞用GC-MS分析几乎无法检测到麦角固醇。而且ERG6基因的缺失显著地诱导了生长抑制和遗传转化能力的降低。为了进一步提高单位细胞产率,研究了麦角固醇合成代谢的关键限速酶编码基因tHMG1,ERG1和ERG11在Δerg5菌株的单独过表达对代谢产物累积量的影响。与野生型菌株相比,在Δerg5菌株中过表达tHMG1时,固醇含量没有明显增加,但对菌株的生长有明显的抑制作用。Hmg1p的过表达导致角鲨烯的大量积累,Erg1p/Erg11p的过表达提高了总甾醇和麦角甾-5,7-二烯醇的产量,且对菌株生长没有明显影响。此外,进一步探究了全局调控因子upc2-1对BY4741细胞麦角固醇合成代谢的影响,在野生型菌株中过表达upc2-1时,麦角固醇产量明显增加,提高了1.25倍。而在Δerg5-upc2-1中麦角甾-5,7-二烯醇水平和总固醇产量均降低,分别比对照菌株下降24.0%和16.8%,进一步考察了细胞的氧化还原水平,发现NADH/NAD~+比率在Δerg5细胞中显著上升,为0.708,是对照组的1.64倍,以上结果表明细胞的氧化还原稳态显著影响终产物的生物合成。本研究所得数据可作为食品级酿酒酵母中参与角鲨烯后生物合成途径的甾醇相关中间体生产的参考。