紫芝胞壁多糖的分离纯化、结构鉴定及其免疫活性研究

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灵芝是一味珍贵的药食两用真菌,具有强身健体、延年益寿的功效,在中国有着悠久的历史记载。紫芝是灵芝家族中的重要成员,与赤芝一同收录于2000年版的《中国药典》中,成为法定灵芝药材之一。多糖作为紫芝中的主要活性成分,具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降糖保肝、解毒等多种功效。目前,紫芝多糖的研究集中于菌丝体多糖及子实体水溶胞内多糖,然而已有研究表明,食用菌的细胞壁中的多糖成分也有良好的免疫活性,提取紫芝水溶性胞内多糖后,也剩余有大量的残渣,因此有必要对紫芝水提后的残渣进行研究,寻找可以进一步开发的活性多糖。本论文以紫芝子实体水提后的残渣为研究对象,通过超微粉碎、提取、分离纯化获得紫芝细胞壁多糖,并对分离、纯化的多糖的理化性质、化学结构和免疫活性进行考察,为紫芝细胞壁多糖的深入开发利用提供科学数据。本论文的主要研究结果如下:通过对紫芝子实体水提残渣进行超微粉碎、热水浸提、分步醇沉(30%、50%、70%)获得紫芝细胞壁多糖粗提物(30%、50%、70%醇沉沉淀和70%醇沉上清组分)。对醇沉组分样品的得率、多糖含量、分子量分布和单糖组成进行分析。结果发现,多糖粗提物的总得率为2%,其得率显著高于紫芝子实体水溶性胞内多糖的得率。多糖粗提物主要集中在30%、70%醇沉沉淀和70%醇沉上清部分;按照分子量分布的大小,又可将粗提物分为大分子量组分(~10~6 g/mol)和小分子量组分(10~3~10~4g/mol)。各组分的多糖含量均高于75%,大分子量组分的多糖含量为98.99%,单糖组成主要以葡萄糖为主;小分子量组分(~10~4 g/mol)的多糖含量为97.17%,小分子量组分(~10~3 g/mol)的多糖含量为75.33%,小分子量组分中除了具有与子实体水溶性胞内多糖相同的五种单糖(岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖)外,还含有少量的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸组分。通过低浓度乙醇沉淀、离子交换柱层析和凝胶柱层析对醇沉粗提物进一步的分离纯化,共获得7个均一多糖。从30%醇沉组分中分离出1个大分子量(155.2?10~4g/mol)的均一葡聚糖GSCW30E-20E;通过离子柱层析从70%醇沉组分中洗脱分离出水相组分GSCW70E-W(2.2?10~4 g/mol)和盐相组分GSCW70E-S(2.5?10~4g/mol),其中盐相组分表现出一定的体外免疫活性。通过离子柱层析、凝胶柱层析从70%醇沉上清中分离出4个小分子量均一多糖,GSCW70EU-W2(5.6?10~4g/mol)、GSCW70EU-W4(0.8?10~4 g/mol)、GSCW70EU-S1(55.1?10~4 g/mol)、GSCW70EU-S2(3.2?10~4 g/mol)。其中GSCW70EU-W4为主要组分,具有显著的体外免疫活性。通过红外光谱分析、甲基化分析以及核磁共振分析对部分均一多糖的结构进行表征,对大分子量多糖GSCW30E-20E的结构进行解析:大分子量葡聚糖GSCW30E-20E既具有α构型也有β构型。每9个β-(1,3)-葡萄糖残基和1个α-(1,4)-葡萄糖残基相连为主链,每3个β-(1,3)-葡萄糖残基主链上通过β-(1,6)-糖苷键连有一个葡萄糖残基为支链。小分子量组分GSCW70E-W和GSCW70EU-W4既具有α构型也有β构型,GSCW70E-S只具有β构型。此3个小分子量组分多糖结构的主链以β(1,3)、β(1,4)和β(1,6)连接为主,支链在β(1,3,4)和β(1,3,6)上。
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