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颌骨创伤,肿瘤手术等导致的颌骨缺损重建是颌面外科面临的临床难题。随着组织工程学的发展,利用间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)来治疗骨缺损将成为新的治疗方式。MSCs具有多向分化的潜能及活跃增殖的能力。它的良好成骨活性使它成为骨组织生物工程重要的细胞来源。如何提高诱导MSCs向成骨细胞定向分化的能力,并使其更好应用于临床骨缺损修复呢?以往大量研究集中于添加外部刺激因素优化MSCs的成骨能力,而很少关注MSCs本身的细胞结构在成骨分化中可能发挥的作用及其机制。近来,MSCs细胞膜上的结构成为关注热点。细胞膜是细胞响应外部刺激的主要部位。它的上面分布有许多细胞质膜微囊(Caveolae),是细胞表面信号的处理中心。构成Caveolae的主要结构蛋白小窝蛋白-1(Caveolin-1)可以和许多信号分子相互作用参与调节细胞增殖,分化等过程。MSCs及其分化的成骨细胞表面均含有Caveolin-1。本研究拟采用体外培养小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs);碱性磷酸酶活性测定(Alkaline phosphatase activity assay,AKP);实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR);蛋白质印迹(Western Blot,WB)等方法来探讨小鼠BMSCs定向分化为成骨细胞过程中Caveolin-1的作用及其作用机制。本研究进行如下:第一部分:研究Caveolin-1在诱导小鼠BMSCs成骨分化过程中的表达变化;方法:小鼠BMSCs原代分离提取及体外传代扩大培养,分为成骨诱导组和未诱导组,分别在培养的第3d,7d,10d,14d几个时间点,采用茜素红染色和AKP的方法对诱导成骨进行鉴定,RT-PCR和WB分别检测各组细胞Caveolin-1mRNA、蛋白的表达情况。结果:RT-PCR结果显示在同一时间点成骨诱导组细胞表达Caveolin-1 mRNA的量高于未诱导组,成骨诱导组细胞表达Caveolin-1 m RNA的量随着成骨诱导时间的推移不断升高;WB结果显示在同一个时间点成骨诱导组细胞表达Caveolin-1蛋白的量高于未诱导组,成骨诱导组细胞表达Caveolin-1蛋白的量以时间依赖性的方式不断增高。结论:本实验从mRNA、蛋白水平证实BMSCs表达Caveolin-1的量随着成骨分化的进行不断增加。Caveolin-1可能参与调控BMSCs成骨分化过程。第二部分:研究Caveolin-1参与调控小鼠BMSCs成骨分化的机制。方法:小鼠BMSCs原代提取及体外传代培养,分为四组,添加不同浓度PD98059到成骨诱导液中,培养4天后,AKP对细胞进行活性测定,培养21天后对细胞进行茜素红钙化结节染色。SiRNA ERK1/2,SiCaveolin-1转染BMSCs,WB方法检测不同时间点(5,40,60min)P-ERK1/2含量。体外培养BMSCs细胞株,免疫荧光观察Caveolin-1在BMSCs的分布;采用标准基础培养基或含有β-甘油磷酸钠、vitamin C、地塞米松、1,25-二羟维生素D3的成骨诱导培养基BMSCs;RT-PCR、茜素红染色鉴定成骨;在成骨诱导液中加入不同剂量的MAPK/ERK1/2信号抑制剂PD98059,AKP、茜素红钙化结节染色观察其对成骨细胞形成的影响;Caveolae结构破坏剂甲基-β-环糊精(Methyl beta cyclodextrin pretreatment,MβCD)预处理BMSCs,WB测定ERK1/2、P-ERK1/2的含量变化;胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase,CHOD)预处理BMSCs,WB测定ERK1/2、P-ERK1/2的含量变化。结果:免疫荧光结果显示Caveolin-1在小鼠BMSCs的细胞膜、细胞质中都有表达;RT-PCR、茜素红钙化结节染色结果显示体外诱导BMSCs定向分化成了成骨细胞;不同浓度PD98059均可抑制BMSCs分化为成骨细胞;MβCD预处理BMSCs后,ERK1/2含量不变,P-ERK1/2含量减少;CHOD预处理后BMSCs,ERK1/2含量不变,P-ERK1/2含量增加。结论:MAPK/ERK1/2信号通路参与调控小鼠BMSCs成骨分化,Caveolae可能是ERK1/2磷酸化的场所,Caveolin-1可能通过聚集ERK1/2磷酸化分子到Caveolae抑制BMSCs成骨分化。