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目的：构建携带端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)基因的真核表达载体pZsGreen1-C1-TERT重组质粒,观察转染TERT基因后对SD大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)生物学效应的影响,研究EPCs和转染TERT基因的EPCs移植对5/6肾切除模型大鼠的肾脏修复作用及其可能机制。方法：1.构建携带TERT基因的真核表达载体pZsGreen1-C1-TERT质粒：采用RT-PCR方法从幼鼠肝脏总RNA中扩增出TERT片段,通过双酶切方法将其与pZsGreen1-C1载体连接,得至pZsGreen1-C1-TERT重组质粒。重组质粒经限制性内切酶BglI和EcoR Ⅰ酶切,进行凝胶电泳鉴定和DNA序列分析。2.分离、培养EPCs:采用密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,EGM-2特异性培基诱导培养EPCs。通过细胞形态观察、细胞免疫荧光细胞表面标志鉴定、摄取DIL-ac-LDL和结合FITC-UEA-Ⅰ能力试验鉴定EPCs。3.转染pZsGreen1-C1-TERT质粒至EPCs:采用脂质体Lipofectam-ineTM2000将重组质粒pZsGreen1-C1-TERT转染至EPCs(pZsGreen1-C1-TERT-EPCs),并pZsGreen1-C1转染至EPCs(pZsGreen1-C1-EPCs)设为空质粒对照组。MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测早期凋亡情况,Western blot和Real-Time PCR检测细胞内TERT mRNA和蛋白表达。4.检测EPCs和转染TERT基因的EPCs移植对5/6肾切除模型大鼠的肾脏保护作用及其机制：雌性6周龄SD大鼠随机分为假手术组(Sham,24只)、5/6肾切除模型组(Model,24只)、EPCs移植组(EPCs-N,24只)、pZsGreen1-C1-EPCs移植组(pZ-EPCs-N,40只)、pZsGreen1-C1-TERT-EPCs移植组(pZ-TERT-EPCs-N,40只)。各组于5/6肾切除术后一周分别尾静脉注射PBS、PBS、EPCs、pZsGreen1-C1-EPCs和pZsGreen1-C1-TERT-EPCs细胞悬液1ml。于注射后3d、1w、2W、3W、4W、6W、8W、12w各处死2只pZ-EPCs-N组和pZ-TERT-EPCs-N组大鼠,取新鲜肾脏、肝脏、脾脏、心脏及血涂片,在倒置荧光显微镜下观察各组织绿色荧光蛋白Green1的表达。同时于注射后4W、8w、12w收集尿液和血液用于检测24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮和内生肌酐清除率,收集肾组织进行肾脏组织病理分析,计算CD34阳性管周毛细血管密度,用Western blotting、Real-Time PCR方法检测TERT、TGF-β1、角蛋白、波形蛋白、α-SMA、VEGF蛋白和基因表达。结果：1.用RT-PCR方法从幼鼠肝脏总RNA中扩增出的基因为3399bp,与所需大小TERT cDNA一致。对重组质粒pZsGreen1-C1-TERT进行酶切、凝胶电泳和DNA序列分析,结果显示基因大小和基因序列与目的基因TERT一致。2.骨髓单个核细胞经过EGM-2诱导后呈现内皮祖细胞形态,细胞表面同时表达CD133、vWF和VEGFR-2,能够同时摄取DIL-ac-LDL和结合FITC-UEA-Ⅰ。3.重组质粒pZsGreen1-C1-TERT和空质粒pZsGreen1-C1转染内皮祖细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,转染率为70%。EPCs组和pZsGreen1-C1-EPCs组细胞在14d、21d和28d均有较低水平的TERT mRNA和蛋白表达,且28d时表达量较14d表达量均明显降低(P均<0.05)。培养第28d时,pZsGreen1-C1-TERT-EPCs组细胞增殖活性明显高于EPCs组和pZsGreen1-C1-EPCs组细胞(P均<0.05)、凋亡比例显著低于EPCs组和pZsGreen1-C1-EPCs组细胞(P均<0.05)。4.(1)尾静脉注射后,表达Green1的移植细胞pZsGreen1-C1-EPCs和pZsGreen1-C1-TERT-EPCs逐渐定位于残肾中。(2)在各时间点,Model组大鼠体重增长和肌酐清除率均明显低于Sham组(P<0.05),24h尿蛋白定量、血清尿素氮、肌酐水平均高于Sham组(P<0.05);EPCs-N组、pZ-EPCs-N组和pZ-TERT-EPCs-N组在第8w和第12w血清尿素氮、肌酐水平较Model组降低(P<0.05),肌酐清除率较Model组升高(P<0.05),尤其以12w时pZ-TERT-EPCs-N组明显(P<0.05)。(3)与Sham组相比,Model组肾间质病理评分明显增高(P<0.05),肾间质管周毛细血管密度降低(P<0.05),且随时间延长病变逐步加重；细胞移植后三组大鼠肾脏病理损伤较Model组均降低(P<0.05),管周毛细血管密度有不同程度增高；12w时pZ-TERT-EPCs-N较EPCs-N组、pZ-EPCs-N组治疗效果更明显。(4)TERT mRNA和蛋白在Model组和Sham组肾组织中无表达,在EPCs-N组、pZ-EPCs-N组仅第4w有少量表达,在pZ-TERT-EPCs-N组4W、8w和12w均有表达,且均高于EPCs-N组、pZ-EPCs-N组第4w时表达量(P<0.05)。(5)TGF-β1mRNA和蛋白在Sham组仅低量表达,Model组4W、8W、12w表达逐渐增高(P<0.05)；各移植组表达量较Model组均有降低(P<0.05),pZ-TERT-EPCs-N组降低最明显(P<0.05)。(6)与Sham组相比,Model组大鼠开始进行性高表达波形蛋白和α-SMA,低表达角蛋白(P<0.05)；与Model组相比,EPCs-N组和pZ-EPCs-N组波形蛋白、α-SMA表达上调和角蛋白表达下调水平均有减弱(P<0.05),pZ-TERT-EPCs-N组在第12w时效果更显著。(7)VEGF表达在Model组表达量明显低于Sham组,EPCs-N组、pZ-EPCs-N和pZ-TERT-EPCs-N组VEGF基因和蛋白水平表达较Model组均增高(P<0.05)。(8)相关性分析显示,管周毛细血管密度与24h尿蛋白定量、血清尿素氮、肌酐均呈显著负相关,与肌酐清除率呈正相关,与肾间质病理评分显著负相关,与TGF-β1、波形蛋白和α-SMA的表达均呈显著负相关,与角蛋白和VEGF表达呈显著正相关。结论：1.成功构建了重组质粒pZsGreen1-C1-TERTo2.成功将骨髓单个核细胞诱导分化为骨髓EPCs,并导入TERT基因重组质粒,构建了具有高表达TERT基因、高增殖活性的pZsGreen1-C1-TERT-EPCs。3.尾静脉注射移植骨髓EPCs能够显著修复5/6肾切除大鼠模型的肾脏病理损伤,改善肾功能,其机制可能与上调VEGF表达和保护肾间质微血管损伤、以及下调TGF-β1表达和阻遏肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)的发生有关。TERT基因重组的EPCs能够显著提升EPCs的肾脏损伤修复作用。