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目的：1刺梨苷(KI)是从蕨麻中提取出的主要活性成分之一，本实验室前期研究表明蕨麻正丁醇部位(NP)对心肌缺氧引起的损伤具有保护作用，但其作用机制尚未明确。本实验通过建立H9c2心肌细胞缺氧损伤模型，研究刺梨苷对心肌细胞缺氧损伤的保护作用。2在应激反应发生时，细胞可通过P38-MAPK途径介导激活MK-2引起αB-晶体蛋白(CryAB)发生磷酸化。αB-晶体蛋白(CryAB)是在心脏中含量最多的小分子热休克蛋白，其对心肌缺氧诱发的损伤发挥着重要的作用。通过建立H9c2心肌细胞缺氧损伤模型，观察刺梨苷对P38-MAPK和CryAB水平的影响及变化，对刺梨苷可能作用的机制进行初步探讨。
方法：
1心肌细胞缺氧模型的建立
1.1采用MTT法检测不同缺氧时间H9c2心肌细胞的生长状态，筛选适宜的刺激时间
1.2Westernblot检测不同缺氧时间组p38MAPK、cryAB的表达
2刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤作用研究
2.1用MTT法检测刺梨苷不同浓度对H9c2心肌细胞的细胞活力，确定刺梨苷高、中、低浓度，选维拉帕米为阳性对照药。实验分组：正常对照组、缺氧损伤组、刺梨苷高、中、低浓度、维拉帕米组。
2.2检测心肌细胞LDH外漏量，CK释放量，细胞内SOD活性，MDA和GSH-px含量
2.3流式细胞术检测各组细胞凋亡率
2.4Hochest-PI染色法检测各组心肌细胞的凋亡
2.5激光共聚焦检测各组线粒体膜电位
3刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤机制研究
3.1Western-Blot检测各组p38、phospho-p38、cryAB、phospho-cryAB、Erk、磷酸化Erk、Nf-κb、Bcl-2、Bax、Cytc、Caspase-3蛋白
3.2观察p38阻滞剂SB303580对刺梨苷作用的影响：确定SB303580阻滞剂的浓度，分组为正常对照组、缺氧组、刺梨苷+缺氧组、刺梨苷+SB303580阻滞剂+缺氧组。
3.3MTT检测各组细胞活力
3.4流式细胞术检测细胞凋亡率
3.5Western-Blot检测各组phospho-cryAB、phospho-p38、phospho-Nfκb、Bcl-2、Bax、Cytc、Caspase-3的表达
结果：
1H9c2心肌细胞缺氧模型的建立
MTT结果显示H9c2心肌细胞活力随缺氧时间递增而下降，呈时间依赖性，但缺氧6h组与4h组有差异(P＜0.05)，8h组与6h组无差异(P＞0.05)，确定6h为最佳缺氧时间点。
与正常对照组相比，p-p38和p-cryAB在2h组、4h组、6h组、8h组显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，而p38在各个时间点的缺氧组均显著升高(P＜0.01或P＜0.05),p-p38/p38在2h组、4h组、6h组、8h组显著升高(P＜0.01)；在各个缺氧时间点cryAB均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，p-cryAB/cryAB在4h组、6h组、8h组均升高(P＜0.01或P＜0.05)(Fig.2-9)。
2刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤作用研究
2.1刺梨苷浓度的确定：刺梨苷浓度为10-10mol/L时，其吸光度值最高，细胞活性最强(P＜0.01)，其后随浓度降低活性下降，故选10-10mol/L，10-11mol/L，10-12mol/L为刺梨苷后续实验研究浓度。
2.2生化指标测定：H9c2心肌细胞缺氧损伤后LDH外漏量有显著升高，(P＜0.01)。细胞中CK、MDA含量较正常对照组显著增加(P＜0.05)。SOD及GSH-px水平在缺氧损伤后显著降低(P＜0.05)，刺梨苷各浓度组及维拉帕米组可明显减少缺氧引起的LDH外漏量，降低CK水平及MDA含量，同时可升高细胞内SOD活性及GSH-px水平(Fig.12-16)。
2.3Hochest-PI染色：刺梨苷各浓度组及维拉帕米可有效减轻H9c2心肌细胞因缺氧产生的染色质凝集、细胞核固缩等凋亡的形态学变化(Fig.17-20)。
2.4流式细胞术检测：与正常对照组相比，缺氧损伤组心肌细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)，刺梨苷各浓度组可明显降低细胞缺氧损伤后凋亡率(P＜0.01)，维拉帕米组也可降低细胞凋亡率，但其作用弱于刺梨苷各剂量组(P＜0.01或P＜0.05)(Fig.21-22)。
2.5细胞膜电位测定：以正常对照组红色荧光强度与绿色荧光强度之比作为标准值，缺氧损伤组荧光强度比值明显低于正常对照组(P＜0.01)，提示缺氧后线粒体膜电位显著降低；与缺氧损伤组相比，刺梨苷各浓度组的荧光强度比值显著提高(P＜0.01)，且呈浓度依赖性，维拉帕米组的荧光强度比值也显著提高(P＜0.05)(Fig.23-24)。
3刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤机制研究
3.1WesternBlot结果：缺氧损伤组phospho-p38、phospho-Nfκb、phospho-Erk、Bax、Cytc、phospho-cryAB蛋白水平较正常组显著升高，刺梨苷各剂量组可显著降低缺氧损伤H9c2心肌细胞内phospho-p38、phospho-Nfκb、phospho-Erk、Cytc、Caspase-3、Bax蛋白水平(P＜0.01)；缺氧损伤组Bcl-2、phospho-cryAB蛋白水平较正常对照组显著降低(P＜0.01)，各剂量的刺梨苷可显著上调缺氧损伤H9c2心肌细胞内Bcl-2、cryAB蛋白、phospho-cryAB蛋白水平(P＜0.01)(Fig.25-38)。
3.2P38阻滞剂SB303580对刺梨苷作用的影响
3.2.1SB303580阻滞剂浓度确定：为20μmol/L时，可将缺氧后升高的phospho-p38恢复至正常组水平，且对细胞活性无明显影响，故确定SB303580阻滞剂的浓度为20μmol/L(Fig.39-41)。
3.3流式细胞术检测结果：与正常对照组相比，缺氧损伤组心肌细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)，刺梨苷组可明显降低细胞缺氧损伤后凋亡的百分率(P＜0.01)，抑制剂组凋亡率略高于刺梨苷组(P＜0.05)(Fig.42-43)。3.4WesternBlot结果：与正常对照组相比，缺氧组phospho-p38、phospho-NFκb、Bax、Cytc、Caspase-3显著升高，Bcl-2、phospho-cryAB、cryAB显著降低；与缺氧组相比，刺梨苷+缺氧组phospho-p38、phospho-NFκb、Bax、Cytc、Caspase-3显著降低，phospho-cryAB、cryAB、Bcl-2升高；与刺梨苷+缺氧组相比，刺梨苷+SB303580阻滞剂+缺氧组phospho-p38(P＜0.01)、Cytc(P＜0.01)、Bax(P＜0.05)显著升高，phospho-cryAB、Bcl-2降低(P＜0.05)(Fig.44-51)。
结论：
1刺梨苷可通过增强H9c2心肌细胞的抗氧化能力减轻缺氧损伤。
2刺梨苷可抑制缺氧损伤诱导的H9c2心肌细胞凋亡。
3H9c2心肌细胞缺氧损伤时，刺梨苷通过下调phospho-p38MAPK水平,上调phospho-cryAB，抑制线粒体细胞色素c的释放，从而抑制线粒体凋亡通路，发挥心肌保护作用。
方法：
1心肌细胞缺氧模型的建立
1.1采用MTT法检测不同缺氧时间H9c2心肌细胞的生长状态，筛选适宜的刺激时间
1.2Westernblot检测不同缺氧时间组p38MAPK、cryAB的表达
2刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤作用研究
2.1用MTT法检测刺梨苷不同浓度对H9c2心肌细胞的细胞活力，确定刺梨苷高、中、低浓度，选维拉帕米为阳性对照药。实验分组：正常对照组、缺氧损伤组、刺梨苷高、中、低浓度、维拉帕米组。
2.2检测心肌细胞LDH外漏量，CK释放量，细胞内SOD活性，MDA和GSH-px含量
2.3流式细胞术检测各组细胞凋亡率
2.4Hochest-PI染色法检测各组心肌细胞的凋亡
2.5激光共聚焦检测各组线粒体膜电位
3刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤机制研究
3.1Western-Blot检测各组p38、phospho-p38、cryAB、phospho-cryAB、Erk、磷酸化Erk、Nf-κb、Bcl-2、Bax、Cytc、Caspase-3蛋白
3.2观察p38阻滞剂SB303580对刺梨苷作用的影响：确定SB303580阻滞剂的浓度，分组为正常对照组、缺氧组、刺梨苷+缺氧组、刺梨苷+SB303580阻滞剂+缺氧组。
3.3MTT检测各组细胞活力
3.4流式细胞术检测细胞凋亡率
3.5Western-Blot检测各组phospho-cryAB、phospho-p38、phospho-Nfκb、Bcl-2、Bax、Cytc、Caspase-3的表达
结果：
1H9c2心肌细胞缺氧模型的建立
MTT结果显示H9c2心肌细胞活力随缺氧时间递增而下降，呈时间依赖性，但缺氧6h组与4h组有差异(P＜0.05)，8h组与6h组无差异(P＞0.05)，确定6h为最佳缺氧时间点。
与正常对照组相比，p-p38和p-cryAB在2h组、4h组、6h组、8h组显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，而p38在各个时间点的缺氧组均显著升高(P＜0.01或P＜0.05),p-p38/p38在2h组、4h组、6h组、8h组显著升高(P＜0.01)；在各个缺氧时间点cryAB均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，p-cryAB/cryAB在4h组、6h组、8h组均升高(P＜0.01或P＜0.05)(Fig.2-9)。
2刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤作用研究
2.1刺梨苷浓度的确定：刺梨苷浓度为10-10mol/L时，其吸光度值最高，细胞活性最强(P＜0.01)，其后随浓度降低活性下降，故选10-10mol/L，10-11mol/L，10-12mol/L为刺梨苷后续实验研究浓度。
2.2生化指标测定：H9c2心肌细胞缺氧损伤后LDH外漏量有显著升高，(P＜0.01)。细胞中CK、MDA含量较正常对照组显著增加(P＜0.05)。SOD及GSH-px水平在缺氧损伤后显著降低(P＜0.05)，刺梨苷各浓度组及维拉帕米组可明显减少缺氧引起的LDH外漏量，降低CK水平及MDA含量，同时可升高细胞内SOD活性及GSH-px水平(Fig.12-16)。
2.3Hochest-PI染色：刺梨苷各浓度组及维拉帕米可有效减轻H9c2心肌细胞因缺氧产生的染色质凝集、细胞核固缩等凋亡的形态学变化(Fig.17-20)。
2.4流式细胞术检测：与正常对照组相比，缺氧损伤组心肌细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)，刺梨苷各浓度组可明显降低细胞缺氧损伤后凋亡率(P＜0.01)，维拉帕米组也可降低细胞凋亡率，但其作用弱于刺梨苷各剂量组(P＜0.01或P＜0.05)(Fig.21-22)。
2.5细胞膜电位测定：以正常对照组红色荧光强度与绿色荧光强度之比作为标准值，缺氧损伤组荧光强度比值明显低于正常对照组(P＜0.01)，提示缺氧后线粒体膜电位显著降低；与缺氧损伤组相比，刺梨苷各浓度组的荧光强度比值显著提高(P＜0.01)，且呈浓度依赖性，维拉帕米组的荧光强度比值也显著提高(P＜0.05)(Fig.23-24)。
3刺梨苷抗心肌细胞缺氧损伤机制研究
3.1WesternBlot结果：缺氧损伤组phospho-p38、phospho-Nfκb、phospho-Erk、Bax、Cytc、phospho-cryAB蛋白水平较正常组显著升高，刺梨苷各剂量组可显著降低缺氧损伤H9c2心肌细胞内phospho-p38、phospho-Nfκb、phospho-Erk、Cytc、Caspase-3、Bax蛋白水平(P＜0.01)；缺氧损伤组Bcl-2、phospho-cryAB蛋白水平较正常对照组显著降低(P＜0.01)，各剂量的刺梨苷可显著上调缺氧损伤H9c2心肌细胞内Bcl-2、cryAB蛋白、phospho-cryAB蛋白水平(P＜0.01)(Fig.25-38)。
3.2P38阻滞剂SB303580对刺梨苷作用的影响
3.2.1SB303580阻滞剂浓度确定：为20μmol/L时，可将缺氧后升高的phospho-p38恢复至正常组水平，且对细胞活性无明显影响，故确定SB303580阻滞剂的浓度为20μmol/L(Fig.39-41)。
3.3流式细胞术检测结果：与正常对照组相比，缺氧损伤组心肌细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)，刺梨苷组可明显降低细胞缺氧损伤后凋亡的百分率(P＜0.01)，抑制剂组凋亡率略高于刺梨苷组(P＜0.05)(Fig.42-43)。3.4WesternBlot结果：与正常对照组相比，缺氧组phospho-p38、phospho-NFκb、Bax、Cytc、Caspase-3显著升高，Bcl-2、phospho-cryAB、cryAB显著降低；与缺氧组相比，刺梨苷+缺氧组phospho-p38、phospho-NFκb、Bax、Cytc、Caspase-3显著降低，phospho-cryAB、cryAB、Bcl-2升高；与刺梨苷+缺氧组相比，刺梨苷+SB303580阻滞剂+缺氧组phospho-p38(P＜0.01)、Cytc(P＜0.01)、Bax(P＜0.05)显著升高，phospho-cryAB、Bcl-2降低(P＜0.05)(Fig.44-51)。
结论：
1刺梨苷可通过增强H9c2心肌细胞的抗氧化能力减轻缺氧损伤。
2刺梨苷可抑制缺氧损伤诱导的H9c2心肌细胞凋亡。
3H9c2心肌细胞缺氧损伤时，刺梨苷通过下调phospho-p38MAPK水平,上调phospho-cryAB，抑制线粒体细胞色素c的释放，从而抑制线粒体凋亡通路，发挥心肌保护作用。