人类基因组计划的实行推动了大肠杆菌基因组测序的完成,为大肠杆菌突变菌的构建和代谢研究提供了遗传学的基础.本文选取有代表性的中心代谢途径单基因敲除大肠杆菌进行考察,包括IpdA、poxB、sucA和sucC基因敲除大肠杆菌.其中,前两个基因编码连接糖酵解途径和三羧酸循环的酶,后两个基因编码三羧酸循环酶.根据生长特性、基因表达、酶活、胞内代谢物浓度以及基于碳13标记实验的代谢通量分析来考察这些单基因敲除对大肠杆菌代谢的影响. lpdA基因敲除大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体均缺陷,该突变菌株的表型与野生菌有显著不同.在LB培养基中,利用葡萄糖阶段,葡萄糖的利用速率降低,细胞生长缓慢,由于生成大量的丙酮酸,细胞产率非常低;吸收丙酮酸阶段,产生D-乳酸、乙酸、琥珀酸和L-谷氨酸.基于酶活和胞内代谢物浓度的测量结果,发现丙酮酸的吸收是丙酮酸氧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸合酶.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶共同作用的结果.通过丙酮酸氧化酶吸收的丙酮酸被转化成乙酸然后通过乙酰辅酶A合成酶、磷酸乙酰转移酶-乙酸激酶共同作用生成乙酰辅酶A来支持细胞的生长.lpdA突变菌中积累的丙酮酸在基因表达水平和酶活水平激活了D-乳酸脱氢酶,造成了D-乳酸的积累.三羧酸循环的中断激活了乙醛酸途径.L-谷氨酸在突变菌中的大量积累是由于其前体代谢物α-酮戊二酸的积累造成的. poxB基因敲除降低了大肠杆菌细胞的葡萄糖吸收速率、细胞生长速率和生物量产率,升高了大肠杆菌的氧气消耗速率和二氧化碳释放速率.丙酮酸氧化酶的缺失并没有导致显著的丙酮酸积累,从这一点我们可以看出,有氧条件下丙酮酸的代谢主要依赖于丙酮酸脱氢酶复合体,而丙酮酸氧化酶并不起决定作用.酶活的测定结果表明丙酮酸氧化酶的缺失导致了中心代谢途径酶活的改变..poxB突变菌在合成培养基中葡萄糖激酶酶活上升,但是由于其它一些糖酵解酶如6-磷酸果糖激酶和1,6-二磷酸果糖醛缩酶活力的下降导致糖酵解途径的代谢通量降低.在LB培养基中,三羧酸循环酶如柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶在.poxB突变菌中被抑制.丙酮酸氧化酶的缺陷同时也导致了6-磷酸葡萄糖脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶活力的升高.这说明该酶虽然在正常大肠杆菌的代谢中不起决定作用,但还是具有一定的调节作用.特别是该酶在lpdA突变菌中起着非常重要的作用,如果在lodA突变菌中如果抑制丙酮酸氧化酶,细胞停止生长. sucA和sucC基因位于同一个操纵子.sucABCD,均编码三羧酸循环酶.其中sucA参与编码α-酮戊二酸脱氢酶复合体,sucC参与编码琥珀酰辅酶A合成酶.虽然.sucA和sucC基因拥有这些相似点,但是这两个基因的缺失对大肠杆菌代谢的影响却有很大的差异.实验结果表明,三羧酸循环酶的缺陷并不一定都会影响细胞的生长速率..sucA基因的缺失显著降低了大肠杆菌的生长速率,而sucC基因的缺失并没有明显影响细胞的生长速率.sucA突变菌中的α-酮戊二酸脱氢酶复合体的缺失导致了α-酮戊二酸的积累,而在大肠杆菌中α-酮戊二酸是合成谷氨酸的代谢前体,从而导致谷氨酸的积累.尽管.sucC基因编码的琥珀酰辅酶A合成酶负责催化α-酮戊二酸脱氢酶复合体的下游反应,但是并没有导致α-酮戊二酸和L-谷氨酸的积累. sucA突变菌的葡萄糖吸收速率降低,乙酸的产量降低,并且能够吸收利用乙酸.乙酸激酶在 sucA突变菌中活力下降直观地解释了该突变菌产生的乙酸量较少的原因,而糖酵解途径活力的降低揭示了乙酸产生量减少的根本原因是下降的糖酵解途径的代谢通量.乙醛酸途径的显著激活实现了乙酸的再利用.与之相对的是,sucC突变菌的葡萄糖吸收速率与野生菌相比并没有明显的变化,sucC突变菌产生非常大量的乙酸但是并不利用产生的乙酸.乙酸激酶在.sucC突变菌中活力上升催化产生的乙酸量大大提高,乙醛酸途径并没有因为大量乙酸的生成而被激活,乙酸根本不可能再被吸收利用.连续发酵中,全局调控基因fadR和iclR在sucA突变菌中表达水平的降低促进了aceA基因的表达水平的升高导致了乙醛酸途径的激活,而在.sucC突变菌中表达水平的稳定,使得aceA基因的表达水平与野生菌持平.全局调控基因arcA和fnr的基因表达水平在两个突变菌中的降低,导致一些三羧酸循环酶的激活. 由于三羧酸循环被中断,.sucA和sucC突变菌的氧化还原平衡发生了变化.还原态NADH、NADPH的量减少,氧化态NAD<+>和NADP<+>的浓度明显升高.这两个突变菌中高能物质ATP浓度均有明显增加.根据实验数据推测,对于sucC突变菌,由于乙酸生成途径是大肠杆菌中产生ATP的重要途径,大量乙酸的生成同时也生成了大量的ATP.但是对于.sucA突变菌,因为乙酸生成量降低,所以生成大量ATP的主要途径显然不是乙酸的生成反应,在该突变菌中,氧化磷酸戊糖途径的活力明显升高,而该途径生成的NADPH可以通过电子传递链反应生成ATP.所以sucA和 sucC 两个突变菌虽然表现出来的ATP积累的表型是相同的,但是其代谢的机理却是截然不同的. 来源于以均匀标记葡萄糖、首位标记葡萄糖和天然葡萄糖的混合物为底物进行的<13>C标记实验的<1>H-<13>C NMR 和GC-MS信号被用来研究基因敲除对胞内代谢通量分布的影响.标记实验的主要思想是跟踪来源于底物的标记碳原子,进行基于碳原子同位素的平衡计算.已知底物分子的同位素标记状态和代谢反应网络,根据同位素的平衡,给出一组代谢通量就能够确定中心代谢网络中的中间代谢物的同位素分子的分布,也就是说一组中间代谢物的同位素分子的分布对应着一组代谢通量.由于氨基酸的同位素分子分布可以从他们相对应的前体(中间代谢物)的同位素分子分布推断出来,而前体分子的标记状态是与代谢通量密切相关的,这样氨基酸的同位素分子分布就可以与代谢通量相关联.根据这个原理,模拟氨基酸的NMR和GC-MS信号也与代谢通量相关联.在NMR和GC-MS信号模拟过程中,要进行三种校正,包括天然同位素丰度校正、非稳态校正和同位素的相位校正.最优的代谢通量分布(包括交换系数)是通过最小化NMR 和GC-MS的实验数据和模拟数据之间的差别得到.首先利用MATLAB中自带的基因算法进行全局寻优,然后用MATLAB中局部寻优函数或二阶 Powell收敛方法进行局部搜索,寻找最优解.为了保证结果的可靠性,我们在试验数据的基础上加入正态分布的噪音得到100个数据组,进行统计学分析. 本论文在连续发酵生长条件下,以lpdA和 sucA 单基因敲除大肠杆菌的代谢通量的计算为例建立了计算细胞代谢通量的模型,并且计算所得的结果基本上和其他生物学手段测量的结果相一致.