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H5N1亚型高致病性禽流感(H5N1-Highly Pathogenic Avian Influenza, H5N1-HPAI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的烈性传染病,在我国,接种疫苗仍是防控禽流感的主要手段,目前生产高致病性禽流感疫苗的基质主要仍是鸡胚,然而其存在如下问题：疫苗株的生产周期长,缺乏高质量的鸡胚供应,一旦大流行流感爆发其来源将成为瓶颈,无法及时应对流感疫情。高繁殖力是疫苗候选株的必要特征,而目前多数禽流感病毒无法在MDCK细胞中获得高滴度繁殖的能力。本课题的目标是利用反向遗传学技术产生在MDCK细胞中具有高繁殖力的禽流感疫苗候选株。研究内容主要包括H5N1亚型禽流感疫苗株的构建,重组疫苗株在MDCK细胞中的繁殖条件的优化以及重组疫苗株生物学特性和免疫效果的初步评价。本文以禽流感病毒流行毒株A/mallard/Huadong/lk/2005(简称LK株)和A/Swan/Shanghai/10/2009(简称SH株)分别作为HA、NA基因供体,对HA基因进行突变致弱,利用反向遗传学技术成功构建了两株以PR8病毒为骨架的H5N1亚型禽流感疫苗株。在遗传进化分支上这两个母本毒株分属于clade2.3.4和clade2.3.2, HA基因序列对比分析表明,两者在氨基酸水平上与目前流行毒株均基本保持一致,从而保证了所构建疫苗株的实际应用价值。将拯救的疫苗株分别在六孔板、2L转瓶及15L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验。试验中从接毒剂量、TPCK-胰酶浓度、简化步骤对病毒增殖影响方面进行探索,在接毒后不同时间点采集细胞培养上清,检测血凝效价,以确定重组疫苗株增殖的最佳条件。试验表明,该重组疫苗株可以在MDCK细胞中稳定增殖且试验操作简便、成本较低。通过鸡胚半数感染量(EIDso)、半数组织感染量(TCID50)、鸡胚平均死亡时间(MDT)以及静脉接种指数(IVPI)试验来检测重组疫苗株病毒的生物学特性。对两株疫苗株在MDCK细胞中的生长动力学进行检测,结果表明拯救疫苗株在MDCK细胞中的生长滴度要比母本毒株高出数十倍,从而显示了在MDCK细胞中的高生长表型。试验中将疫苗株分别在MDCK细胞及SPF鸡胚中连续传代10次,测定第1代和第10代病毒的HA、A基因序列,结果比较显示同源性均在99.9%以上,且HA基因裂解位点及加长的NA茎部位点均未发生突变,说明了拯救的疫苗株抗原性的稳定。将MDCK细胞和SPF鸡胚扩增的病毒液分别制备成油乳剂灭活苗,按相同的剂量胸部肌肉免疫3周龄SPF鸡,免疫后3周抗体达到高峰,并以H5Nl亚型强毒进行攻毒,结果显示两株疫苗候选株均具有良好的保护效果,且细胞来源疫苗组具有抗体产生快、上升稳定、水平高等优点。