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目的:结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,在世界范围内其发病率及死亡率均高居前列。近年来,随着饮食结构、社会环境以及生活方式等一系列外在因素的改变,结直肠癌的发病率还在呈现逐年上升的趋势。对于大多数结直肠癌患者来说,手术目前仍是首选的治疗方式,但术后复发及远处转移成为制约患者预后的主要因素。而化疗、靶向治疗及免疫治疗等全身综合治疗的飞速发展,使得患者的预后得到了大幅度的改善。但目前临床使用中的各种结直肠癌治疗药物均存在较严重的毒副作用,且随着用药时间的延长,肿瘤细胞会逐渐出现耐药现象。因此,寻找更加高效、低毒的新型药物,是临床急需解决的问题。药食同源类物质是指既具有丰富的药用价值,又可以作为食品安全服用的一类物质。而从药食同源类物质中提取出的天然产物,因其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种作用,一直是各类新药开发的重要来源。蟛蜞菊内酯是一种从药食同源类植物墨旱莲中提取出来的呋喃香豆素类小分子化合物,具有抗炎、保肝、促骨分化、抗免疫抑制等多种药理学活性。近年来越来越多的研究表明,蟛蜞菊内酯在多种类型的肿瘤中具有良好的抗肿瘤活性,其作用机制主要是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制迁移侵袭以及增加化疗敏感性等途径。然而,目前关于蟛蜞菊内酯对结肠癌细胞的抗肿瘤作用及其潜在的分子机制尚不明确。因此,本研究通过体内和体外实验分析蟛蜞菊内酯的抗结肠癌作用,并进一步阐明其潜在的分子机制。研究方法:1.蟛蜞菊内酯对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响采用不同浓度（0、20、40、60、80、100μM）的蟛蜞菊内酯作用24和48 h,CCK-8法检测蟛蜞菊内酯对结肠癌细胞HCT116和正常结肠上皮细胞CCD841Co N细胞活力的影响。根据上述实验结果,选取40、50、60μM蟛蜞菊内酯处理HCT116细胞24 h进行后续实验,利用光学显微镜观察细胞形态变化、Ed U染色检测细胞增殖率、平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力、DAPI染色观察细胞核形态、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率、western blot检测凋亡相关蛋白（Cleaved PARP、Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax）的表达水平。2.蟛蜞菊内酯抑制结肠癌细胞增殖及诱导凋亡的分子靶点与作用机制研究采用蟛蜞菊内酯（50μM）处理HCT116细胞24 h后,加入适量Trizol收集样品并进行转录组测序,通过对差异基因进行富集分析,筛选蟛蜞菊内酯潜在的作用分子通路。用0、40、50、60μM蟛蜞菊内酯处理HCT116细胞24 h,western blot检测β-catenin总蛋白及其磷酸化水平。通过q RT-PCR和western blot方法检测β-catenin下游靶基因c-Myc和survivin的m RNA和蛋白水平。进一步利用计算机分子对接和分子动力学模拟等技术探讨蟛蜞菊内酯与β-catenin的结合模式,并利用细胞热转变分析实验检测在HCT116细胞中蟛蜞菊内酯和β-catenin之间的结合关系。此外,利用β-catenin真核表达质粒转染细胞,western blot验证β-catenin过表达效果。进一步在转染后加入蟛蜞菊内酯（50μM）继续处理24 h,采用CCK-8检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡、western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。3.蟛蜞菊内酯对结肠癌裸鼠移植瘤的抑癌作用研究利用皮下注射HCT116细胞方式构建裸鼠移植瘤模型,每三日灌胃给予蟛蜞菊内酯,实验期间观察裸鼠状态,测量裸鼠体重和移植瘤体积。采用HE染色观察裸鼠重要器官组织病理改变,TUNEL染色检测移植瘤组织中细胞凋亡情况,免疫组化方法检测移植瘤组织中增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白以及Wnt/β-catenin通路相关蛋白（p-β-catenin（ser675）、c-Myc和survivin）的表达情况。结果:1.蟛蜞菊内酯抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡在体外细胞实验中,随着蟛蜞菊内酯处理浓度的增加（0-100μM）和时间的延长（0-48 h）,结肠癌HCT116细胞活力逐渐降低,呈剂量和时间依赖关系。而在蟛蜞菊内酯有效作用浓度范围内,其对正常结肠上皮CCD841Co N细胞无明显的细胞毒性。根据上述结果,后续选择40、50、60μM蟛蜞菊内酯处理HCT116细胞24 h进行实验。与对照组相比,蟛蜞菊内酯处理后,随着作用浓度增加HCT116细胞逐渐变圆、细胞增殖能力下降。同时蟛蜞菊内酯能以剂量依赖的方式诱导HCT116细胞凋亡,并且这种诱导作用能被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK逆转。检测凋亡相关蛋白发现蟛蜞菊内酯可以上调Cleaved PARP、Cleaved caspase-3和Bax的表达,下调Bcl-2的表达。2.蟛蜞菊内酯靶向β-catenin抑制结肠癌HCT116细胞增殖及诱导细胞凋亡蟛蜞菊内酯处理后HCT116细胞转录组测序结果显示,共有2767个差异基因,其中1457个基因表达上调,1310个基因表达下调。KEGG通路富集分析提示蟛蜞菊内酯对结肠癌细胞的作用通路与Wnt信号通路有关。进一步检测发现蟛蜞菊内酯处理后Wnt信号通路中核心分子β-catenin总蛋白的表达无显著变化,但p-β-catenin（ser675）的表达水平明显下调。同时蟛蜞菊内酯能够显著下调c-Myc和survivin的m RNA和蛋白水平。分子对接等结果提示蟛蜞菊内酯能与β-catenin直接结合,且二者形成的复合物构象相对动态稳定。此外,蟛蜞菊内酯可提高β-catenin蛋白的热稳定性,表明蟛蜞菊内酯与β-catenin在细胞中存在相互作用。成功构建β-catenin真核表达质粒,瞬时转染可以有效上调β-catenin的表达。β-catenin过表达后能显著逆转蟛蜞菊内酯对HCT116细胞的增殖抑制、诱导细胞凋亡。且与单纯蟛蜞菊内酯处理组比较,Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达明显下降,Bcl-2的表达明显升高。3.利用结肠癌裸鼠成瘤模型评价蟛蜞菊内酯的抑癌效果蟛蜞菊内酯能够抑制结肠癌细胞移植瘤的生长,且对裸鼠体重以及心、肝、肾等重要器官无明显影响。蟛蜞菊内酯处理组移植瘤组织中Ki67的表达下调,细胞凋亡率升高。与对照组相比,蟛蜞菊内酯处理后的移植瘤组织中Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达显著升高,Bcl-2的表达显著降低。此外,蟛蜞菊内酯处理后还可以明显下调p-β-catenin（ser675）、c-myc和survivin的表达。结论:1.体外实验显示蟛蜞菊内酯能显著抑制结肠癌细胞增殖和诱导细胞凋亡,且对正常结肠上皮细胞无明显毒性。2.蟛蜞菊内酯可能通过与β-catenin直接结合并抑制β-catenin活性,显著下调其下游靶基因的表达,从而发挥抗结肠癌的作用。3.体内实验证实蟛蜞菊内酯能显著抑制结肠癌移植瘤生长,诱导肿瘤细胞凋亡,但对裸鼠无明显毒副作用,其作用机制可能涉及Wnt/β-catenin信号通路的抑制。