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研究背景:乳腺癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤之一,是城市女性最常见的癌症,且发病率和死亡率逐年上升。乳腺癌是一种多因素,多基因相互作用引起的癌症,但病因及发病机制尚未完全清楚。目前乳腺癌的治疗虽已逐渐从简单的手术、化疗转向手术、化疗、放疗以及生物靶向治疗等多种手段综合治疗的方向,但仍会对患者身心造成巨大的创伤。因此,寻找高效、低副作用的天然化学药物对乳腺癌的预防和治疗具有重大意义。叶黄素(Lutein)又称为植物黄体素,是一种具有抗氧化作用的天然植物化合物,大量存在于花卉、蔬果等绿色植物中,尤其在万寿菊中含量最为丰富。人们通过膳食摄取的叶黄素可经由血液输送到各组织。流行病学研究显示,叶黄素在保护视力、预防白内障、延缓动脉粥样硬化和预防肿瘤等多方面具有重要作用。目的:本实验旨在通过检测叶黄素(Lutein)对人乳腺癌MCF-7细胞中激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)及其上下游信号通路中相关因子的影响,进而研究叶黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其作用机制,为乳腺癌的化学预防及叶黄素作为低副作用的天然抗癌药物的临床研究提供理论依据。方法:1.MTT法检测不同浓度叶黄素(Lutein)对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率。用不同浓度的叶黄素(0、5、10、20、40、80μg/ml)分别处理MCF-7细胞12、24、48h后,用MTT法检测叶黄素对细胞增殖的抑制率。2.流式细胞术检测不同浓度的叶黄素(0、5、10、20、40、80μg/ml)分别处理MCF-7细胞24h后的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。3.采用RT-q PCR检测各组细胞中Nrf2、HO-1的m RNA的表达水平。4.采用Western blot检测各组细胞胞浆和细胞核中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平。5.根据以上实验结果分析设置空白组、3-MA组、叶黄素组、3-MA+叶黄素组进行后续实验。流式细胞术检测空白组及各实验组细胞周期的变化及凋亡率。6.采用RT-q PCR检测空白组及各实验组细胞中PI3K、AP-1、Cox-2和Cyclin D1的m RNA表达水平。7.采用Western blot检测空白组及各实验组细胞中PI3K、AP-1、Cox-2和Cyclin D1的蛋白表达水平。结果1.MTT检测结果显示,叶黄素能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,且抑制作用具有时间和剂量依赖性,即作用时间越长,用药浓度越大时,对MCF-7细胞的增殖抑制作用越强。2.流式细胞术检测结果显示,各组细胞中ROS水平有差异,且随着叶黄素浓度的增大,ROS水平降低更显著。3.RT-qPCR的实验结果显示,与空白组相比,各浓度组Nrf2、HO-1的mRNA表达水平均上调。4.Western blot的实验结果显示,与空白组相比,HO-1的蛋白表达量呈上调趋势,细胞胞浆中Nrf2的蛋白含量基本无差异,而核Nrf2蛋白的含量明显上调。5.Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测结果显示,24h的3-MA组、叶黄素组(40μg/ml)和3-MA+叶黄素(40μg/ml)组的细胞凋亡率与空白组相比均有明显差异(P<0.05),3-MA+叶黄素(40μg/ml)组细胞凋亡率明显大于叶黄素(40μg/ml)组和3-MA组(P<0.05),而叶黄素(40μg/ml)组与3-MA组相比,两组无明显差异。6.细胞周期检测结果显示,与空白组相比,各实验组G0/G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,且3-MA+叶黄素组更显著,表现为显著地G1期阻滞(P﹤0.05)。7.RT-q PCR的实验结果显示,PI3K、AP-1、Cox-2、Cyclin D1的m RNA表达水平各实验组与空白组相比均下调;叶黄素(40μg/ml)组和3-MA组相比差异较小,3-MA+叶黄素(40μg/ml)组下调更显著(P<0.05)。8.Western blot的实验结果显示,PI3K、AP-1、Cox-2、Cyclin D1的蛋白表达水平各实验组与空白组相比均下调;叶黄素(40μg/ml)组和3-MA组相比差异较小,3-MA+叶黄素(40μg/ml)组下调相对更显著(P<0.05)。结论1.叶黄素可明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,抑制作用具有时间和剂量依赖性。2.叶黄素可诱导Nrf2的表达和核转位,促进抗氧化酶HO-1的表达,进而降低氧化应激水平。3.叶黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增值抑制作用可能是通过上调人乳腺癌细胞内Nrf2的表达,从而促进HO-1的表达,降低细胞内的ROS含量,抑制PI3K的表达,进而导致AP-1及其下游靶基因的的表达下调所介导的。