胶质射脉革菌全基因组解析及降解木质素相关基因的生信挖掘

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白腐真菌能够将木质纤维素完全分解为H2O和CO2,是自然界元素循环的重要参与者,数量多、分布广,但其对木材的降解机理仍存在较大的疑问。本论文以一株选择性降解木质素的白腐真菌胶质射脉革菌BBEL0901为研究对象,在对其全基因组序列进行测序和解析的基础上,进一步采用生物信息学方法对其降解木质素的相关基因进行挖掘和分析,以期明确该菌株降解木质素的基因信息。单核菌株的获取是白腐真菌进行全基因组测序的关键,因此,本论文首先基于单因素实验结合正交试验设计优化了溶菌酶法制备菌株BBEL0901的原生质体的条件,在获得足够数量原生质体的前提下进行原生质体再生,采用细胞核荧光染色、ITS序列分析和杂合度测定从多角度筛选单核菌株。选择合适的单核菌株进行全基因组测序,对所获得的序列进行评估合格后展开后续分析。论文的主要研究内容及结果如下:1.通过单因素实验研究不同菌龄、酶解时间、溶壁酶浓度、转速、稳渗剂种类和浓度对原生质体产量的影响,在此基础上基于正交实验确定了制备菌株BBEL0901的原生质体的最佳条件为:以加富的PDB培养基中静置培养4.5d的菌丝为材料,以0.65 mol/L的NaCl溶液为稳渗剂,用5%的溶菌酶酶解3h并于3000 r/min离心收集原生质体。基于DAPI的细胞核染色法筛选原生质体再生的菌落,获得了 3株单核菌株M73、M74和M81,通过ITS序列比对和Kmer曲线评估其单核体M73,最终确认单核体M73可用作胶质射脉革菌BBEL0901全基因组测序的材料。2.分别采用二代结合三代的测序技术对单核菌株M73进行了全基因组的de novo测序和组装,并对其测序结果进行组学水平的分析。最终产生了 8.23G的原始数据,组装得到43个Scaffolds,测序深度达到133×,其全基因组大小为40.7 Mb,GC碱基含量约为51.41%,共有12,362个编码基因、272个tRNA和18个rRNA。胶质射脉革菌拥有较完整的纤维素、半纤维素和果胶的降解酶系,但关键酶基因的拷贝数相对偏低;具备完整的木质素降解酶系,包括86个与木质素降解相关的基因,13个参与木质素降解的代谢通路,4个以上木质素及其中间体的代谢途径;拥有326个P450蛋白基因,远超大多数白腐真菌。3.对漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的保守结构域、进化关系、启动子顺式元件和蛋白质一、二、三级结构进行了分析。胶质射脉革菌中漆酶的分子量在55.69~106.67 kDa之间,木质素过氧化物酶的分子量在38.21-45.36 kDa之间,锰过氧化物酶的分子量在40.08-40.51 kDa之间,大多数定位在细胞外,个别定位在细胞膜上。Lacl-Lac5拥有完整的铜离子结合域,过氧化物酶有完整的血红素结合位点,亲缘关系与同属的Phlebia chrysocreas和Phlebia brevispora较接近,在其上游存在着多种顺式作用元件结合位点。综上,胶质射脉革菌具有完整的参与木质纤维素降解的酶系,拥有较强的木质素降解酶系统和丰富的木质素代谢通路,该研究成果为进一步解析胶质射脉革菌选择性降解木质素的分子机制提供了重要参考。
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