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猪瘟(CSF)是严重危害养猪业的烈性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列入须申报的动物传染病之一,每年给全球各地的养猪业带来巨大的经济损失。猪瘟病毒(CSFV)是CSF的病原体,其与边界病病毒(BDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)1 型(BVDV-1)、BVDV2 型(BVDV-2)和长颈鹿瘟病毒(Pestivirus ofgiraffe)共同属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)。CSFV是有囊膜的正链RNA病毒,基因组全长约12.3 kb。CSFV的E2蛋白锚定于病毒囊膜蛋白的外表面,其主要作用是在病毒感染和入侵过程中诱导机体产生广泛性的抗体。目前,BVDV的晶体结构已经解析,N端含有两个免疫球蛋白结构,C端包含一个细长的β-折叠股结构域,这种独特的结构可能也存在于CSFV,同时,已有的研究显示,CSFV和BVDV在病毒粒子结构、基因组结构等方面均很相近,在血清学上存在交叉反应,提示可通过同源建模分析CSFV E2蛋白的抗原结构。为了降低CSFV与BVDV之间的交叉反应,同时保持良好的抗原性,本研究参考BVDV E2蛋白的晶体结构,对CSFVE2蛋白的空间结构进行预测。根据预测的蛋白结构,将CSFV E2蛋白截短,保留E2全部抗原区B/C/D/A(E2B/C/D/A),并在真核系统中表达。同时,用Western blotting等方法对蛋白的表达情况进行检测,得到了大小约26 kDa的目的条带,结果表明E2B/C/D/A成功表达。同时,构建了稳定表达E2B/C/D/A的CHO细胞系,筛选出稳定表达的阳性克隆CHO-E2B/C/D/A。然后大量收集表达CHO-E2B/C/D/A的细胞上清,通过Strep-tag对E2B/C/D/A蛋白进行纯化。为了建立特异检测CSFV的血清学检测方法,将纯化的E2B/C/D/A作为抗原进行包被用于间接ELISA(iELISA)试验,并通过棋盘滴定法对其抗原的最佳工作浓度、血清稀释度、辣根过氧化酶(HRP)标记的抗体稀释度等进行了优化。优化后的条件分别为2.5μg/mL、50倍和20000倍稀释。随后,利用优化后的条件建立了 iELISA方法,并通过对BVDV和BDV等相关病原的抗体阳性血清及CSFV E2抗体阳性血清进行检测,确定该诊断方法的特异性。结果显示,该iELISA与BVDV以及其它猪的主要病原没有血清学交叉反应。此外,选取了已知抗体效价的猪瘟血清8份来确定该方法的敏感性。用倍比稀释法将血清进行一系列稀释,结果显示,强阳性血清稀释12 800倍稀释时,该诊断方法检测结果为阳性,说明该方法具有良好的敏感性。然后对288份现地送检样品进行了检测,同时,与IDEXX CSFV阻断ELISA的检测结果做对比。其符合率为90.8%。以上结果表明,该iELISA检测方法特异、敏感,可用于CSF特异性血清学检测,具有良好的应用前景。