脑胶质瘤(gliomas)是世界上发病率最高的脑肿瘤，发病率为十万分之十二。由于脑恶性胶质瘤浸润性很强，手术切除率很低，术后高复发，临床上的标准治疗方法是采用手术切除加术后放射治疗。但是，由于大多数胶质瘤对放射线不敏感或者放射治疗一段时间后对放射线的敏感性降低，即使提高照射剂量仍不能取得满意疗效。因此，研制高效的放射增敏剂，增加射线对肿瘤细胞的杀伤作用，对提高脑胶质瘤的治愈率、延长生存期具有重要意义。含有未甲基化CpG的寡核苷酸片段(CpG oligonucleotides，CpG ODN/CpG DNA)是具有免疫激活作用的寡核苷酸，有文献报道，CpG ODN可以提高肺癌、恶性脑胶质瘤组织对化疗和放疗的敏感性，可增加单次放疗和分次放疗中射线对肿瘤的杀伤作用，具有化疗和放射增敏作用。含12个碱基的硫代寡核苷酸CpG ODN107(CpGoligonucleotide107，5’-TGGCGCGGGGCG-3’)是本实验室经早期筛选的对肿瘤有放射增敏作用的CpG ODN。 CpG ODN107在体内、外的药效学研究均表明CpG ODN107联合射线可抑制肿瘤生长，诱导脑胶质瘤细胞自噬性死亡，延长动物生存时间。CpGODN107作为治疗脑胶质瘤新型放射增敏剂，合成方法简单、毒性低、质量可靠、放射增敏效果显著，研发成功将为脑胶质瘤患者带来福音，并将产生巨大的社会效益和经济效益。本研究项目是国家“重大新药创制”科技重大专项“放射增敏剂候选药物CpGODN107的研究”(2009ZX09103-051)的重要研究内容之一，通过研究CpG ODN107在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，阐明其在动物体内的药代动力学特征，为该药物的药效学、毒理学研究以及临床新药报批提供资料，同时也为其他此类化合物的药代动力学研究提供方法参考和新的研究思路。主要研究内容与方法：一、生物样品中CpG ODN107及其代谢物的检测方法建立通过优化和改良色谱和质谱条件，建立高效液相色谱-三重四级杆质谱联用(LC-MS/MS)的方法测定血浆中CpG ODN107及其代谢物(链缩短序列3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1)的浓度，并进行方法学确证，包括方法的专属性、灵敏度、定量线性范围、日内及日间精密度、准确度、回收率、样品稳定性和基质效应的考察。在此基础上，针对不同生物样本，如尿、粪、胆汁和组织均浆液，进行药物提取方法的再优化，建立不同生物样品中CpG ODN107药物浓度的测定方法，并进行部分方法学确证。二、CpG ODN107及其代谢物的血浆动力学特征描绘小鼠单次静脉注射四个剂量(2.5、5、10和15mg/kg)的CpG ODN107血药浓度—时间曲线图，以及小鼠单次静脉注射15mg/kg CpG ODN107的代谢物的血药浓度—时间曲线图，采血时间点为给药前和给药后2min、5min、15min、30min、60min、120min、180min、240min、360min、540min和720min；通过房室模型拟合和统计矩的方法计算CpG ODN107在四个给药剂量以及代谢物在15mg/kg给药剂量下的相关药代动力学参数；确定CpG ODN107在四个给药剂量是否存在AUC和Cmax依赖于成正比增高的线性药代动力学。三、CpG ODN107的分布特征①选择高、中、低三个剂量浓度的药物分别与空白小鼠、人血浆以及人血清白蛋白、等孵育，采用超过滤法，经LC-MS/MS检测含量，研究CpG ODN107与不同种属血浆蛋白的结合情况；②选择5mg/kg剂量组，小鼠尾静脉注射给药，在给药后0.5h、1h、2h、4h、10h、24h处死，解剖，提取肝、心、脑、脾、肺、肾、肠、肌肉、生殖腺等重要组织、器官药物，LC-MS/MS药测定物浓度，研究CpG ODN107在各组织器官中的分布特征；③脑内注射荧光标记的CpG ODN107，通过小动物活体荧光成像方法研究CpG ODN107在脑中的分布特征。四、CpG ODN107的排泄特征选择5mg/kg的给药剂量，经尾静脉注射，在小鼠体内分段收集24h的粪、尿；选择3.5mg/kg的给药剂量，经尾静脉注射，在大鼠体内分段收集24h的粪、尿和胆汁；生物样品经处理后LC-MS/MS测定药物的浓度，研究CpG ODN107在尿、粪和胆汁中的排泄特征。主要研究结果：一、生物样品中CpG ODN107及其代谢物的LC-MS/MS检测方法建立和确证优化了CpG ODN107及其代谢物的LC-MS/MS测定条件；改进在血浆和组织中CpG ODN107的提取方法，血浆、尿、粪、胆汁样本经酚仿液-液萃取结合固相萃取提取药物，组织样本经DNA提取试剂盒去除内源性核苷酸后再经固相萃取提取药物；以15个T碱基构成的硫代序列为内标，以乙腈：0.05%氨溶液=20：80为流动相，分析柱为Extend C18柱(150mm×2.1mm,3.5μm)，以高纯氮气作为干燥气，ESI源负离子扫描，MRM检测方式进行检测。CpG ODN107在血浆中20～5000ng/mL浓度范围内线性关系良好，在尿、胆汁中20～4000ng/mL浓度范围内线性关系良好，在组织中0.1～40μg/g浓度范围内线性关系良好。3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1四种代谢物在血浆中10～2500ng/mL浓度范围内线性关系良好。本方法专属性强、线性关系良好，灵敏度、精密度、准确度均符合《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》的要求，可进行体内药物分析。二、CpG ODN107以及代谢物的血浆动力学特征小鼠单次静脉注射四个剂量(2.5、5、10和15mg/kg)CpG ODN107后，经DAS软件进行房室模型拟合，结果表明CpG ODN107在小鼠体内药动学过程符合静脉注射的三室模型；统计矩法计算得到平均滞留时间MRT(0-t)分别为48.37、58.94、54.19和53.74min；CL分别为0.013、0.012、0.013和0.005L/min/kg；梯形法计算得到的药时曲线下面积AUC(0-t)分别为185974.8，412136.3和732853.5ng/mL*min。AUC0-t和Cmax的线性分析结果表明，CpG ODN107在小鼠体内呈现非线性动力学的特征。小鼠单次静脉注射15mg/kg CpG ODN107后，在血浆中很快检测到3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1四种代谢物，其AUC(0–t)分别为215957.9、116663.0、64572.2和105595.5ng/mL*min，MRT(0–t)分别为35.2、78.0、118.2和70.3min。采用AUCm/AUCp表示代谢物相当量，3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1分别为6.93%，3.75%，2.07%和3.39%，血浆中主要代谢物为3′N-1。三、CpG ODN107的分布特征①采用超滤法分别测定了CpG ODN107与人、小鼠血浆以及人血浆白蛋白(HAS)的蛋白结合率，结果表明CpG ODN107与各种属来源的血浆蛋白结合率均较高(>96%)。CpG ODN107与HAS的结合率>90%，说明在人血浆中主要与白蛋白结合，并且随着药物浓度的增加，与白蛋白的结合出现饱和现象。②小鼠5mg/kg尾静脉注射CpG ODN107后，主要分布在肝、肾和脾组织。CpGODN107按在给药0→24h的AUC排序由大到小依次为：肝＞肾＞脾＞肌肉＞心＞肺＞睾丸＞肠＞脑。在脑组织中未检测到CpG ODN107，说明其不容易通过血脑屏障。从整个分布情况看，CpG ODN107在肝中浓度较其他组织高，分布与消除均较快；给药后1小时，CpG ODN107在肾脾中的分布在1小时最多，可能与其在肾脏中排泄有关；CpG ODN107在心、肌肉、肺、肠和睾丸组织中分布均较低，在肺中消除最慢。③小鼠0.25mg/kg脑内注射CpG ODN107后，药物主要分布在进针位置，4h可观察到CpG ODN107扩散到整个脑组织，给药48h后仍未完全消除。四、CpG ODN107的排泄特征研究结果表明，该药是以原型药物和缩短的寡核苷酸的形式从小、大鼠体内排泄掉，尿排泄为主要排泄途径。静脉给药24h内，CpG ODN107在小鼠尿和粪中总共排泄的全长序列的量占总给药量的2.70%，尿和粪分别为1.79%，0.91%，以尿排泄为主；CpG ODN107在大鼠尿和粪中总共排泄的全长序列的量占总给药量的0.84%，尿和粪分别为0.63%，0.21%，以尿排泄为主；大鼠胆汁中均未检测出CpG ODN107。研究结论：1.建立了多种生物样品中CpG ODN107和代谢物含量的LC-MS/MS的测定方法。所建方法专属性强、线性关系良好、灵敏度、精密度和准确度均能满足药代动力学研究的要求。2. CpG ODN107在小鼠体内的药代动力学性质符合三室模型，在体内消除过程属于非线性药代动力学；3′N-1是血浆中主要代谢物，代谢物的在血浆中动力学变化趋势与原型药物相似。3. CpG ODN107与不同种属来源的血浆蛋白结合大于96%，主要与白蛋白结合，随药物浓度增加结合呈现饱和性；血管内给药后CpG ODN107主要分布在肝、肾和脾组织，分布与消除快，脑中未见分布；脑内给药后，CpG ODN107主要分布在给药部位的脑组织，且消除慢。4. CpG ODN107在小鼠、大鼠体内，药物以原型药和链缩短的寡核苷酸的形式排泄。尿排泄为主要途径，胆汁中排泄量极低，未能检测到。