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西藏芜菁(Brassicarapassp.rapa,俗称芫根)是一种适应了极地环境的食、药、饲三用作物,藏民传统上将其用于缓解和抵御高原性缺氧。课题组前期研究揭示,西藏芜菁块茎提取物的正丁醇相(n-butanol fraction of Tibetan Turnip,n-bu-TT)是其抗缺氧的有效活性部位,对香豆酸(p-Coumaricacid,CA)及其葡萄糖苷(p-Coumaricacid-β-D-glucopyranoside,CAG)为主要功效成分之一。进一步研究又表明,n-bu-TT和CA具有良好的预防缺氧性肺水肿的作用,并提示可能同时具有预防缺氧性脑水肿的功效。本文在前期研究的基础上,首先建立急性常压缺氧性肺/脑水肿的动物模型,评价n-bu-TT和CA预防缺氧性肺/脑水肿的作用,然后建立小鼠肺微血管内皮细胞和脑星形胶质细胞的缺氧模型,探讨CA防护缺氧性肺/脑细胞损伤的作用机制。主要研究内容及成果如下:1.建立急性常压缺氧性肺水肿的ICR(Institute of Cancer Research)小鼠模型,探明n-bu-TT)和CA预防缺氧性肺水肿的有效作用剂量。将100只健康雄性小鼠随机分为5组,设1个常氧对照组和4个低氧试验组,每组各20只。常氧对照组灌胃无菌水,4个低氧试验组分别灌胃无菌水、400 mg/kg.bw的n-bu-TT、100mg/kg.bw的CA和2mg/kg.bw的地塞米松(阳性对照药物),每日灌胃1次,连续4d。第4天灌胃lh后,将低氧试验组小鼠置于含氧量为(9.5士0.2)%的常压低氧舱中,保持24h后取出,测定各组小鼠的肺组织含水量(Lung water content,LWC)、肺血管通透性、肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白浓度、血浆一氧化氮(Nitricoxide,NO)和内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)含量,用光镜和电镜观察肺组织的显微结构,并用免疫组化方法检测肺组织中紧密接合蛋白(Occludin)的表达水平。结果显示,在含氧量为9.5%的低氧环境下,400 mg/kg.bw的 n-bu-TT和100 mg/kg.bw的CA干预后实验小鼠的LWC和BALF中蛋白浓度均显著低于低氧模型组;同时,这两组小鼠的肺组织气血屏障完整性良好,NO释放增强,ET-1释放被抑制,Occludin蛋白表达水平增加。n-bu-TT和CA表现出与常用药物地塞米松(Dexamethasone,DXMS)相近的对小鼠缺氧性肺水肿的预防作用。2.建立急性常压缺氧性脑水肿的ICR小鼠模型,探明n-bu-TT和CA预防缺氧性脑水肿的有效作用剂量。然后将100只健康雄性小鼠随机分为5组,设1个常氧对照组和4个低氧试验组,每组各20只。常氧对照组灌胃无菌水,4个低氧试验组分别灌胃无菌水、400 mg/kg.bw的n-bu-TT、100 mg/kg.bw的CA和2mg/kg.bw的地塞米松,每日灌胃1次,连续4d。第4天灌胃后lh,将低氧试验组小鼠置于含氧量为(9.5±0.2)%的常压低氧舱中,保持24h后取出,检测各组小鼠的脑组织含水量(Brain water content,BWC)、血脑屏障通透性、Na+-K+-ATPase活性、线粒体膜电位、氧化应激及炎症因子等指标。同时,用光镜和电镜观察脑组织的显微结构,并采用免疫组化法检测脑组织中Occludin的表达水平。结果显示,在含氧量为9.5%的低氧环境下,400 mg/kg.bw的n-bu-TT和100 mg/kg.bw的CA干预后小鼠的BWC和血脑屏障通透性均显著低于低氧模型组,同时这两组小鼠的Na+-K+-ATPase活性和线粒体膜电位增加,氧化应激和炎症指标均得到有效抑制,Occludin蛋白表达水平增加。n-bu-TT和CA表现出与地塞米松相近的对小鼠缺氧性脑水肿的预防作用。3.建立ICR小鼠的肺微血管内皮细胞缺氧模型,探索CA预防缺氧性肺水肿的作用机制。设置5个试验组,依次为常氧对照组、低氧模型组、低氧+25 μmol/L的CA组、低氧+50 μmol/L的CA组和低氧+10 μmol/L的地塞米松组。常氧预处理1 h后,将4个低氧试验组置于三气培养箱(1%O2+5%C02+94%N2)中,24 h后取出。检测各组细胞的存活率,检测细胞培养上清液中NO和ET-1释放水平、以及HIF-1α、VEGF、iNOS、eNOS和ET-1mRNA水平,利用透射电镜观察各组肺微血管内皮细胞的超微结构。同时,采用RT-qPCR和Western Blot技术检测低氧肺水肿模型小鼠肺组织样本中HIF-1α、VEGF、iNOS、eNOS和ET-1mRNA水平及蛋白表达量。结果显示,CA预防缺氧性肺水肿的主要作用机制涉及HIF-1α、VEGF、iNOS和ET-1mRNA及蛋白表达水平的降低,进而降低了肺组织屏障通透性,促进了 NO释放,并抑制了 ET-1合成。4.建立ICR小鼠的脑星形胶质细胞缺氧模型,探索CA预防缺氧性脑水肿的作用机制。设置5个试验组,依次为常氧对照组、低氧模型组、低氧+25 μnol/L的CA组、低氧+50μmol/L的CA组和低氧+25 μmol/L的地塞米松组。常氧预处理1 h后,将4个低氧试验组置于三气培养箱(1%02+5%C02+94%N2)中,24h后取出。检测各组细胞的存活率,测定HIF-1α、VEGF、ET-1和AQP4mRNA水平,利用透射电镜观察各组脑星形胶质细胞的超微结构。同时,采用RT-qPCR和Western Blot技术检测低氧脑水肿模型小鼠脑组织样本中HIF-1 α、VEGF、ET-1和AQP4mRNA水平及蛋白的表达量。结果表明,CA预防缺氧性脑水肿的主要作用机制涉及HIF-lα、VEGF、ET-1和AQP4mRNA水平及蛋白表达的降低,进而降低了脑组织屏障通透性,缓解了缺氧造成的星形胶质细胞水肿,达到了预防小鼠缺氧性脑水肿的作用。本文对西藏芜菁滋补增氧、预防急性高原病(缺氧性肺/脑水肿)的物质基础和作用机制进行了系统研究和阐述,对这一极地宝贵资源的深入开发具有重要的理论意义和现实价值。