大豆[Glycine max(L.)Merr.]是重要的粮油作物,籽粒中油脂、蛋白质、异黄酮类、皂苷类等物质含量丰富,在人类食物、动物饲料、工业生产上都有广泛的利用。但土地盐碱化已成为影响大豆产量和品质的一个重要因素。盐碱地主要分为两种:盐地和碱地。碱胁迫主要由NaHC03和Na2C03胁迫引起,除了 Na+外,还有C032、HCOC-的危害、有相对较高pH值(约8.5-10.8)、土壤结构差等特点。我国盐碱地面积约3.5×107公顷,我国大豆主产区之一的东北松嫩平原是世界三大碱土地集中分布区之一,碱地面积大约3.73×106公顷,并且每年以1.4%的速度扩增。大豆耐碱相关性状是复杂的数量性状,受多基因控制,至今大豆耐碱基因和耐碱机制的研究进展缓慢。因此,挖掘大豆耐碱基因、探索大豆耐碱分子机制,对大豆耐碱遗传育种、充分利用我国盐碱地提高大豆产量、改善农业生产均具有重要的意义。为了挖掘大豆耐碱胁迫的候选基因/QTL,本研究选取来自不同地区的大豆种质资源129份,进行耐碱(NaHCO3)性指标评价和种质资源筛选;依据筛选结果,选择一份高度耐碱的野生大豆(Glycine soja)N24852进行转录组分析,对大豆响应碱胁迫的差异表达基因进行功能分类和富集分析等生物信息学分析,探讨大豆耐碱的分子机制;并利用两个重组自交系群体进行大豆耐NaHC03胁迫相关性状的QTL定位。主要结果如下:1、从不同地区选取129份大豆种质资源,在NaHC03梯度胁迫16天后,对耐碱等级(STR)、相对叶绿素含量(RSPAD)、相对地上部干重(RSDW)和叶片Na+浓度、K+浓度、Ca2+浓度、Mg2+浓度、P 浓度、Fe 浓度、Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/(K++Ca2+)等12个性状进行测定。统计学分析表明,叶片Na+浓度与STR呈极显著负相关(r =-0.67,P<0.01)。叶片 Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/(K++Ca2+)与 STR 也呈极显著负相关(P<0.01),即 Na+浓度、Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/(K++Ca2+)越低,植株耐碱性越强。STR、Na+浓度、Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/(K++Ca2+)的表型变异系数范围是 30.67-44.13%,广义遗传率变化范围是60.32～85.60%。我们认为用STR结合Na+浓度、Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/(K++Ca2+)等生理指标有利于准确评价大豆的耐碱性以及筛选优良的耐碱大豆种质资源。2、依据所选择的5个耐碱鉴定指标,即STR、Na+浓度、Na+/K+、Na+/Ca2+和Na+/(K++Ca2+),对129份大豆材料的耐NaHCO3特性进行评价,共鉴定出STR≥2 4.5,且Na+浓度低、Na+/K+、Na+/Ca2+和Na+/(K++Ca2+)等比值小的耐碱材料8份,分别是N24852、蒙8206、黔西七月豆、黑鼻青、蒙自细青豆、鸡蛋豆、白花、玉溪黄豆;STR<1.5,且Na+浓度高、Na+/K+、Na+/Ca2+和Na+/(K++Ca2+)等比值大的敏碱材料18份,如正阳148、临河大粉青等。3、对耐碱野生大豆N24852培养14天后,进行90 mM NaHC03胁迫,处理0.5天、1天后,取根系进行转录组测序及生物信息学分析。以“伪发现率FDR ≤ 0.01和|log2倍数变化|≥ 1”为阈值,比较同一时间点的处理和对照的样品,共鉴定到449个差异表达基因(DEGs),NaHC03胁迫0.5天、1天后,分别有95个和140个上调表达基因,108个和135个下调表达基因。对14个DEGs进行qRT-PCR表达分析验证,结果与RNA-seq基因表达(log2倍数变化值)呈极显著(P<0.01)正相关(决定系数R2 =0.9763),表明两者的结果一致。GO富集结果显示,在这两个时间点分别富集到10个和38个GO术语。NaHC03胁迫0.5天后,转录因子相关的GO术语在上调表达基因中显著富集;NaHCO3胁迫1天后,上调表达基因显著富集到了与转运相关的GO术语。进一步的转录因子(TF)富集结果显示,NaHC03胁迫0.5天后,NF-YA转录因子家族显著富集。在碱胁迫0.5天和1天后,分别检测到9个和27个与离子转运相关的基因差异表达,如ABC转运体(ABC transporter),铝活化苹果酸转运体家族(ALMT),谷胱氨酸受体(GLR),硝酸转运体/质子依赖型寡肽家族(NRT/POT),和S-型阴离子通道(SLAH)等,推测这些基因在大豆响应碱胁迫过程中对调节体内离子平衡具有重要作用。KEGG通路富集结果显示,在NaHC03胁迫1天后,显著富集到了“苯丙烷生物合成”和“苯丙氨酸代谢”两个通路。4、利用耐碱栽培大豆蒙8206为父本,两个敏碱栽培大豆正阳148、临河大粉青为母本分别杂交,获得两个重组自交系(RIL)群体NJRIZM6(126个家系)、NJRILM6(104个家系),在F2:8代构建遗传图谱,对其F2:9代材料在人工气候室进行NaHC03胁迫后,对 STR、Na+浓度、K+浓度、Ca2+浓度、Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/(K++Ca2+)等7个耐碱相关性状进行调查和QTL定位,利用Windows QTL Catographer V2.5软件的复合区间作图(CIM)法进行QTL定位。在NJRIZM6群体中共检测到22个QTL位点,分布在 1、3、4、6、9、10、12、13、14、16、17、18 等 12 条不同染色体(Chr)上的17个QTL Cluster区域。在NJRILM6群体中共检测到19个QTL位点,分布在1、2、3、5、7、8、9、12、13、16、20 等 11 条不同染色体上的 14 个 QTL Cluster区域。这两个群体中,定位到三个共同的、新的耐碱相关性状QTL Clusters区域:Gm01G47.71-51.44、Gm09G0.32-1.60、Gm13G31.16-32.94。Chr.9 上检测到一个与叶片 Na+浓度、Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/(K++Ca2+)四个性状显著相关的 QTL Cluster Gm09G0.32-1.60,包括3个QTL位点,表型变异解释率范围为10.14%～15.26%。Chr.1上检测到一个与STR显著相关的QTL Cluster Gm01G47.71-51.44,包括3个QTL位点,表型变异解释率分别为6.27%、11.59%、19.79%;Chr.13上检测到一个与叶片Ca2+浓度、Na+/Ca2+显著相关的QTL Cluster Gm13G31.16-32.94,包括3个QTL位点,表型变异解释率范围为6.51%～8.30%,我们把该位点作为一个Suggestive QTL(2.5<LOD值<1000次迭代测验获得的LOD阈值)。