荔枝(Litchi chinensis Sonn)是亚热带地区的主要特色水果。我国是荔枝的主产国,种植面积和产量均居世界第一。荔枝加工、消费产生的副产物果壳和果核中含有大量酚类物质。已有研究表明荔枝果壳富含自然界少见的A型原花青素等酚类物质,并含有多种寡聚体同分异构体。由于原花青素结构复杂,同分异构体种类繁多,迄今为止,荔枝果壳中原花青素的组成仍不是很清楚。原花青素的化学结构与其生物活性有密切关系,葡萄籽来源的B型原花青素的抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)等生物活性已为研究所证实,但关于以A型为主的荔枝果壳原花青素生物活性及其机制研究还较少见。脂质代谢紊乱和炎症是促进AS发生发展的主要机制,B型原花青素的抗AS作用与其改善脂质代谢有关,并具有抗炎作用,而A型原花青素因为结构与B型明显不同,对其抗AS作用及分子机制有待进一步深入研究。基于以上问题,本文在优化建立荔枝果壳原花青素的超高压辅助浸提工艺的基础上,纯化出荔枝果壳原花青素寡聚体提取物(LPPO),建立荔枝果壳原花青素化合物HPLC-QqQ-MS定性定量分析方法,比较分析原花青素化合物在华南地区主栽荔枝品种果壳中的含量及其在果壳储藏过程中的变化规律,通过高脂喂养的apoE基因敲除(apoE-KO)小鼠模型,探究LPPO的抗AS作用,并围绕肠道和肝脏内胆固醇代谢调控以及主动脉和血液的炎症反应调节探究了其分子机制。主要研究结果如下:1.荔枝果壳原花青素的提取分离与化学结构表征以压力、保压时间、乙醇浓度和固液比为考察因素,采用响应面法优化出荔枝果壳原花青素超高压辅助浸提工艺的最佳工艺条件为:以70%乙醇为浸提溶剂,压力295 MPa,保压时间13 min,液固比16:1。在此工艺条件下原花青素得率为2.4%。比较了超高压辅助溶剂浸提、传统溶剂浸提和超声辅助溶剂浸提三种方法中荔枝果壳原花青素提取率和提取物抗氧化活性的差异,发现超高压辅助溶剂提取分别较传统的乙醇浸提和超声辅助溶剂浸提方法原花青素提取率提高30.8%和13.9%,氧自由基清除能力(ORAC)提高28.9%和16.4%、细胞抗氧化活性(CAA)提高40.6%和31.2%。荔枝果壳原花青素提取物经大孔树脂吸附和乙酸乙酯萃取纯化后得到LPPO,与纯化前相比,其总原花青素含量提高了 211.3%,ORAC和CAA抗氧化活性分别提高了 300.6%和325.4%。采用HPLC-QqQ-MS方法结合标准品从荔枝果壳中共鉴定出表儿茶素、山奈酚-3-芸香糖苷、水仙苷、芦丁、槲皮素-3-芸香糖-7-鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷和香蒲新苷共8个黄酮单体化合物,原花青素A1(PA1)、A2(PA2)、B2(PB2)和C1(PC1)共4个原花青素寡聚体以及2个A型二聚体同分异构体、1个B型二聚体同分异构体、6个A型三聚体同分异构体和4个B型三聚体同分异构体。HPLC-QqQ-MS定量分析粗提物和LPPO中上述化合物含量,发现纯化前后提取物中原花青素组成基本一致,但表儿茶素、PA2和其他原花青素寡聚体总含量从纯化前的16.05%提高至87.3%。2.不同品种荔枝果壳原花青素构成谱及其抗氧化活性14个荔枝品种果壳中酚类物质总含量及其抗氧化活性有明显基因型差异。HPLC-QqQ-MS法结合标准品分析不同品种荔枝果壳中酚类化合物组成,发现不同荔枝品种果壳中含量最高的酚类物质是表儿茶素,其次是PA2,A型原花青素寡聚体和B型原花青素寡聚体总含量在14个荔枝品种果壳中的变幅分别为950-3077μg/g和94.8-446.4 μg/g,原花青素类化合物(包含表儿茶素)总含量的变幅分别为1421-5233 μg/g,占检出酚类化合物总含量的76.9-94.6%,表明原花青素为荔枝果壳主要的酚类成分。荔枝果壳的ORAC和CAA抗氧化活性与其总原花青素含量均呈极显著正相关关系(P<0.01),基于原花青素等的含量和抗氧化活性等指标进行系统聚类分析,黑叶、妃子笑、糯米糍和三月红4个品种聚为一类,是原花青素等酚类物质含量最高且抗氧化活性最强的品种。3.不同储藏条件下荔枝果壳中原花青素组成及含量变化比较了 4℃下7 d和室温(26±2℃)下96 h储藏过程中荔枝果壳中原花青素类化合物含量变化规律。结果发现,在4℃和室温储藏时荔枝果壳总原花青素含量均随储藏时间的延长而减低,且以4℃储藏第1 d和室温储藏12 h内减低速度最快,之后降低速度较缓慢。在4℃储藏7 d后总原花青素含量降低24.3%,室温储藏96 h后降低53.9%。HPLC-QqQ-MS分析发现,在两种储藏条件下,荔枝果壳中表儿茶素、PA2等24个酚类单体化合物含量均随储藏时间的延长而减少。在4℃储藏条件下,原花青素C1、A1和异槲皮苷等化合物降解速度较快,储藏7天后分别减少44%、63%和86%,其他酚类化合物降幅都接近或低于35%。室温储藏时,表儿茶素、山奈酚-3-芸香糖苷、芦丁、异槲皮苷、原花青素A1、原花青素C1、A型二聚体同分异构体1和B型三聚体同分异构体4共8个酚类化合物的减低幅度超过新鲜果壳含量的40%。因此,4℃储藏更有利延缓荔枝果壳中酚类物质分解破坏。4.LPPO的安全性评价及其抗AS作用研究安全性评价:通过经口急性毒性实验和30 d喂养亚急性毒性实验评价了 LPPO的安全性,发现一次灌胃给予LPPO 2000 mg/kg bw对KM雌性和雄性小鼠均没有显示出毒性作用,LPPO的经口急性毒性>2000mg/kgbw;250,500和1000mg/kgbw连续灌胃给予断乳的SD大鼠,对雌、雄性动物体重、食物利用率、血象和血生化等指标均未观察到亚急性毒性反应。抗AS作用研究:采用高脂喂养的apoE-KO小鼠诱导AS模型,连续16 w灌胃给予低剂量(100 mg/kgbw)和高剂量(200mg/kgbw)的LPPO,通过组织病理分析和血清、肝脏生化指标分析,研究LPPO对主动脉窦AS斑块面积,肝脏脂质聚集和血液、肝脏及粪便脂质含量以及机体抗氧化状态的影响。发现摄入低、高剂量的LPPO明显减轻了小鼠主动脉AS病变,斑块面积占血管腔面积百分比较模型组分别降低了 12.7%和25.1%,显示出明显的抗AS作用。LPPO明显减轻了高脂饲料引起的小鼠肝脏脂肪变性,降低血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)或总胆固醇(TC)水平(P<0.05),肝脏脂肪变性评分从HFD组的2.75显著性降至低剂量LPPO组的2.10(P<0.05)和高剂量组的1.64(P<0.05),两个LPPO处理组粪便中胆固醇、甘油三酯等脂质和总胆汁酸水平明显高于模型组(P<0.05);同时,LPPO处理能够明显降低小鼠血清和肝脏的MDA含量(P<0.05),提高SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶活性(P<0.05)。提示LPPO的抗AS作用可能与其调节高脂膳食诱导apoE-KO小鼠体内的胆固醇代谢和抑制氧化应激有关。5.LPPO抗AS作用分子机制研究在上述研究确证了 LPPO的抗AS作用基础上,采用qPCR、Western blot、液相芯片等方法探究了 LPPO对小肠胆固醇吸收转运相关基因的表达,肝脏脂质代谢相关核受体PPARα、PPARy、SREBP2和LXRα的核转位以及下游胆固醇代谢基因表达,主动脉NF-κB的活化和炎症蛋白表达水平等的影响。结果表明LPPO能够显著性抑制高脂饲料诱导的apoE-KO小鼠小肠粘膜NCP1L、ACAT2和MTP等的表达(P<0.05),增加 ABCG5/G8 的表达(P<0.05);LPPO 促进了 apoE-KO 小鼠肝脏中PPARα、PPARy和LXRα的核转位,进而增加LDLR、CYP7A1和ABCG5/G8等的表达(P<0.05)。表明LPPO通过抑制肠粘膜上皮细胞对胆固醇的吸收,促进肝脏从循环中摄取LDL-c,并将胆固醇代谢为胆汁酸排入肠道来改善胆固醇代谢紊乱。此外,LPPO能够降低小鼠主动脉中IκBα的磷酸化水平(P<0.05),减少ICAM-1、VCAM-1和COX-2等粘附分子和炎性蛋白表达(P<0.05),同时降低血清中IL-1β、IL-6、IL-12p70、TNF-α、Rantes和MIP-1a等炎性因子和趋化蛋白水平(P<0.05),增加抗炎细胞因子IL-10(P<0.05)的含量。说明LPPO能够抑制主动脉组织NF-κ3的活化,下调炎性因子的表达,减轻动物血管内的炎性反应。LPPO通过调节胆固醇代谢紊乱和抑制血管壁炎症反应发挥抗AS作用。本研究的主要创新点:①确证了以A型寡聚体为主的荔枝果壳原花青素的抗动脉粥样硬化作用,揭示出其分子机制为:调节胆固醇在小肠的吸收转运和在肝脏的摄取及代谢转化从改善胆固醇代谢紊乱;抑制主动脉组织NF-κB的活化,从而下调炎性因子、粘附分子和趋化因子等的表达,减轻血管组织炎症反应。②建立了荔枝果壳原花青素超高压辅助提取工艺和原花青素化合物的HPLC-QqQ-MS定性、定量分析方法,从荔枝果壳中鉴定出原花青素A1、A2、B2、C1以及13个A型和B型原花青素二聚体或三聚体同分异构体,实现了原花青素同分异构体在液相难以有效分离的情况下进行准确定量。③系统表征了不同荔枝主栽品种果壳中原花青素化合物的组成谱及含量差异,探明了原花青素构成谱在不同储藏条件下的变化规律,确定了有利于原花青素保存的荔枝果壳储藏条件。本研究的意义:本研究以富含A型原花青素的荔枝果壳为材料,探明了其抗AS作用,并从调节肝脏和肠道内的胆固醇代谢稳态,抑制血管组织的炎性反应角度揭示其分子机制,为以A型原花青素为主要成分的植物资源的开发利用提供了理论依据。建立了荔枝果壳原花青素的高效制备技术和定性定量分析技术以及减缓原花青素降解的原料保藏方法,为基于原花青素的荔枝加工副产物的精深加工利用和功能性食品开发提供了技术支撑,对促进荔枝产业的可持续发展具有重要意义。