论文部分内容阅读
通用塑料的大量应用造成了严重的白色污染,聚己内酯(PCL)等生物可降解塑料引起了人们强烈的兴趣。PCL是由ε-己内酯开环聚合所得的半结晶性脂肪族聚合物,具有低熔点、高结晶性、良好的共混性以及出色的生物相容性,故在生物医学等领域具有广泛的应用前景。目前,对PCL生物解聚酶的研究还不多,影响了对其生物降解机制的正确评价。本论文利用实验室筛选的PCL降解菌株Pseudomonas aeruginosa DS0801;对其产酶条件进行了优化,采用单因素实验及正交试验,得到了菌株的最适产酶条件,即初始pH为7.0、培养温度为32℃、装液量为50/250mL、含碳量为0.15%(w/v)、含磷量为1.904mg/mL。在此条件下发酵48h后,菌株分泌的解聚酶活力提高约48.5%。对菌株DS0801产生的解聚酶进行了分离纯化及性质的表征。将发酵液经离心、超滤、冻干后,得到浓度较高的粗酶,先后使用DEAE Sepharose Fast Flow与Phenyl Sepharose6Fast Flow层析柱纯化PCL解聚酶,该酶的相对分子质量约为30.4KDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8,在50℃以下、pH6-9内可保持良好的稳定性。反应体系中添加1mM的K+、Fe2+、Mn2+及10mM的K+、Na+、Mn2+可以促进酶活,而Zn2+、Cu2+等金属离子及EDTA、SDS和PMSF等化学试剂可显著抑制酶活。该酶降解PCL可生成单体、二聚体及三聚体,其中二聚体占主要部分,推测其优先切割链端的第二个酯键。对该酶进行MALDI-TOF-PMF质谱分析,发现其与一株铜绿假单胞菌分泌的胞外脂肪酶有99.99%的相似性,使用其降解p-nitrophenyl (C2-C16)底物,发现该酶对长链底物的降解活力要高于短链底物,进一步证明该酶属于脂肪酶。对该脂肪酶的酶学性质,特别是其有机溶剂耐受性进行了研究。结果显示,该酶在甲醇、丙酮等有机溶剂孵育6h后仍具有较高酶活力。脂肪酶在有机溶剂中可以催化一些重要的合成反应,酶对有机溶剂的耐受性对其应用范围影响较大。鉴于该酶良好的有机溶剂耐受性,其在工业上的应用值得期待。