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戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要经胃肠道传播。我国先后曾发生多次HE流行,1986-1988年新疆南部因水源污染发生过世界上规模最大的HE暴发流行,约有12万人发病。近年来我国HE的发病率和死亡率早逐年上升趋势,己被列为因HE发病和死亡而引起的经济负担最为严重的国家之一。为了有效控制HE,HE疫苗已被世界卫生组织推荐为21世纪最优先发展的疫苗之一。
HEV主要分成4个基因型,研究报道显示我国主要以4型为主。目前HEV尚无成熟的组织培养体系和经济、合适的小动物模型。难以制备传统的灭活疫苗或减毒活疫苗。因此,HE疫苗的研究主要集中于基因工程疫苗和DNA疫苗上。但迄今为止,尚无HE疫苗批准上市。合适的免疫原对疫苗的制备具有相当重要的作用。本实验室以往的研究将HEV的中和抗原表位定位于HEV ORF2编码蛋白C端的第452-617位氨基酸之间。在此基础上,我们发现第4基因型HEV p179可以在原核系统中获得高效、可溶性表达。经动物实验表明,该蛋白吸附氢氧化铝佐剂后可诱导小鼠产生高滴度的抗-HEV,免疫血清在体外可以中和HEV对细胞的感染。因此,HEVp179可以用作HE疫苗的研究。
最好的疫苗评价途径就是接种易感动物,并进行病毒攻击,观测其保护效果。本研究中我们选用了目前最常用于实验性感染HEV的恒河猴作为实验动物,将制备的重组蛋白HEV p179免疫恒河猴,进行HEV攻击保护实验,观察HE候选疫苗p179的保护效果。
本研究分为以下二个部分：
一、戊型肝炎重组疫苗恒河猴免疫保护的实验研究
9只恒河猴(M1～9)随机分为对照组(M1、M2、M3)和实验组。实验组又分为低剂量组(M4、M5、M6,10μg/只)和高剂量组(M7、M8、M9,20μg/只)。HE候选疫苗p179经铝佐剂(1g/L)吸附后,实验组每只左侧三角肌注射1mL相应剂量抗原,对照组每只注射1mL铝佐剂,免疫程序为0、4、8周。末次免疫后4周,对照组和实验组每只猴均静脉注射1mL 10％HE急性期患者粪便悬液(HEV第4基因型,PCR滴度为107/mL)进行攻击。对照组攻毒后3只猴中2只也现短暂厌食、腹泻,伴精神萎靡等症状：攻毒后第3天3只猴均从粪便悬液中检测到HEV RNA,持续5周以上,最长持续7周；攻毒后1周2只猴ALT升高,峰值达150 U～184 U,持续3～4周；攻毒后1周血清抗-HEV IgM阳转,2周后3只猴抗-HEV IgG阳转,第4周达到峰值。实验组6只猴在初次免疫后2周抗-HEV IgG阳转,第4～5周达到峰值；免疫及攻毒后6只猴均无异常症状,ALT均正常；高剂量组M7攻毒后1周于粪便中检测到HEV RNA,持续3周,其余5只猴粪便HEV RNA始终阴性。实验结果表明,HEV p179重组疫苗具有良好的免疫保护作用。
二、ELISA定量检测猴血清抗-HEV IgG工作参比品的制备及应用
通过上述研究,我们推测HEV p179的免疫保护作用可能与其诱导的抗体滴度的高低有关。为了方便抗体的定量检测和不同个体之间抗体滴度的相互比较,我们进一步开展了猴血清抗-HEV IgG工作参比品的制备和应用的研究。
首先取不同猴不同时期的HEV p179免疫血清加50％甘油混合之后分装保存,将ELISA检测过程中的所用试剂以及程序标准化,以不同包被批次酶标条在不同时间检测该血清的抗-HEV IgG,经仔细鉴定和定量后作为工作参比血清。处于线性范围的血清稀释度为：1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400。将线性范围内的中间点,即工作参比血清作1:1600稀释时的抗体含量定为1AU/mL(arbitrary unit/mL)。在线性范围内各稀释度OD值与其抗体含量的对数呈线性正相关(R2=0.9955)。
根据工作参比品标准曲线求得样本的抗体含量。12周后,感染免疫组3只猴的抗体含量分别为803AU/mL、3610AU/mL、1278AU/mL;低剂量组3只猴的抗体含量分别为2147AU/mL、2304AU/mL、3442AU/mL;高剂量组3只猴的抗体含鼍分别为236AU/mL、1863AU/mL、2476AU/mL。结果表明,高剂量组中抗体含量为236AU/mL的猴M7在上述攻击试验中出现隐性感染,表现为粪便短暂排毒,与其对疫苗反应性的个体差异有关。
综上所述,本研究得出以下结论,HE候选疫苗p179免疫恒河猴后,中和保护性抗体迅速升高,可以中和HEV的感染,保护恒河猴免受HEV野毒株的攻击。成功制备定量检测猴血清抗-HEV IgGELISA工作参比品,在线性范围内,读取的OD值与抗体含量的对数呈线性正相关(R2=0.995)。根据工作参比品检测猴体抗体水平,结果表明,HE候选疫苗p179具有较好的免疫原性,12周后,其诱导抗体水平不低于感染免疫组的抗体水平。在10μg和20μg免疫剂量范围内,抗体诱导水平并不随免疫量的增加而升高,抗体水平仅与猴体的个体差异有关。