吩噻嗪次氯酸荧光探针的构建及其生物应用研究

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次氯酸(HOCl)作为生理体系中重要的活性氧物种之一,能够维持细胞内的氧化还原平衡,并具有抗菌杀菌的免疫作用。但当体内HOCl浓度过表达时可能会引起一系列疾病,比如类风湿关节炎及动脉粥样硬化。采用简单、快捷、高效的方法实现生理体系中HOCl的精确检测,对相关病理生理过程的监测具有重要价值。在各种检测方法中,荧光分析法凭借灵敏度高、选择性好、响应快速、实时监测等优点一直备受广大科研工作者的青睐。吩噻嗪是一种非平面“蝴蝶”型结构的杂环化合物,作为荧光团母核具有易于官能团化、斯托克斯位移大等优点。在本文中,我们基于吩噻嗪母核中硫原子容易被HOCl氧化成亚砜(S=O)的反应机制成功设计并合成了一系列荧光探针实现了细胞、组织及小鼠中的HOCl成像分析。首先,对已报道的发射波长较短的HOCl探针1-1进行简单的结构修饰,利用放大分子内电荷转移(ICT)的策略将氰基吡啶盐引入吩噻嗪结构中,设计合成了两例长波发射的HOCl荧光探针Cl O-1和Cl O-2。在HOCl作用下,这两个探针在635 nm和614 nm处分别表现出461倍和472倍的荧光增强。其中,相较于响应快速(5 s)、灵敏性高(DL=1.12 n M)的Cl O-1,连有甲氧基结构的Cl O-2发射波长较短且受ONOO-干扰较大。因此,我们利用探针Cl O-1实现了脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞过表达HOCl的荧光成像,并证明了5-氟尿嘧啶刺激下MCF-7细胞中HOCl浓度上调现象。传统的吩噻嗪HOCl荧光探针除了硫原子易被氧化,其活泼的C=C双键化学稳定性也较差,从而对选择性造成干扰。为了进一步提高探针的稳定性和选择性,我们将吩噻嗪与香豆素并环得到具有单一硫原子反应位点的吩噻嗪香豆素PDC。PDC在发射波长503 nm处对HOCl表现出高选择性和高灵敏性的荧光增强。另外,我们还成功地将探针PDC用于多种炎症因子刺激下RAW264.7细胞内源性HOCl的成像分析,并对两种抗炎药物硒代半胱氨酸和甲氨蝶呤的药效进行了有效评估。通过构建小鼠骨关节炎模型,该探针还被成功应用于HOCl水平变化的在体成像。在确保吩噻嗪香豆素类探针高选择性的基础上,为了增加其成像实用性,将PDC中羧基替换为吸电子能力更强的带正电荷吡啶盐,成功合成一例溶酶体靶向性HOCl荧光探针PC-Py。相比于PDC,该探针与HOCl作用后发射波长延长至570 nm,红移了67 nm。该探针响应迅速,选择性好,且p H检测范围广。由于探针PC-Py的超灵敏性(DL=970 p M),我们实现了癌细胞内生性HOCl的成像分析,并可对共存体系中的正常细胞和癌细胞进行有效区分。最后,通过共定位实验,证实该探针可成功靶向到溶酶体中。一个特定的病理生理过程除了表现出氧化应激之外,通常伴有其它微环境变化,比如粘度。因此,同时检测多种微环境变化,可以实现对相关病理生理过程更为精准的检测。通过在吩噻嗪结构中引入具有粘度响应的分子转子,设计合成一例双响应荧光探针PCV。该探针可在不同荧光通道分别对HOCl和粘度表现出增强型荧光信号。随着体系粘度的增大,探针在近红外区(710 nm处)表现出5.5倍的荧光强度变化;随着HOCl浓度升高,在593 nm处出现84倍荧光增强。而在不同极性溶剂中,该探针均呈现弱荧光,消除极性影响。该探针具有良好的生物兼容性,被成功应用于LPS或制霉菌素药物刺激下细胞中HOCl水平或粘度上调的生物成像。最终,通过构建泡沫细胞模型,探针PCV被应用于早期动脉粥样硬化中HOCl和粘度水平变化的同步成像。目前,仍有部分生物实验正在进行和完善中。
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