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交替氧化酶（Alternative oxidase,AOX）是植物线粒体呼吸链中交替氧化途径末端的氧化酶。它主要负责植物线粒体电子传递链中把电子从UQ库传递给O2生成H2O。同时也是细胞氧化还原平衡的重要传感器,有助于维持线粒体中代谢过程的动态平衡。植物在生长过程中难免会遇到外界环境的胁迫,如高温、冷害、高光、重金属、盐及干旱等,它们的生长方式和寿命就会发生改变,所以植物自身就会形成一种内在的防御机制来感知外界环境的细微变化,从而对外界环境给出的刺激做出反应。高等植物中AOX的存在为植物的生长发育提供了很大的作用,它不仅能够传递电子,还能够清除植物体内产生的活性氧。目前对于aox突变体的研究比较少,本实验主要是以aox突变体为材料来研究AOX的功能机制,从而增加对AOX的功能特性和线粒体呼吸作用的认识。拟南芥AOX基因家族共包括五个基因AOX1a、AOX1b、AOX1c、AOX1d、AOX2,分别由AT3g22370、AT3g22360、AT3g27620、AT1g32350、AT5g64210编码。为了研究AOX的功能,首先要得到不同基因型的突变体。所以本实验的主要研究内容是:1、获得拟南芥四种纯合单突变体以及通过CRISPR-Cas9系统得到aox1b突变体;2、在原有突变体的基础上通过杂交技术和CRISPR技术得到其它不同基因型的突变体;3、研究AOX基因在植物线粒体电子传递链中的作用;4、不同基因型突变体的表型观察分析。首先应用CRISPR技术得到了两个不同株系的aox1b突变体,Cas9切割的结果显示其中一个株系的突变体有碱基增加同时Cas9切在了第三个gRNA上,所以在第三个gRNA和第四个gRNA之间少了161 bp的片段,突变体基因组长度最终比野生型少了160 bp。另外一个株系有碱基增加,同时在第四个gRNA上缺失了17个碱基,并且在第四个gRNA前插入了一段137 bp的重复序列,基因组长度最终比野生型增加了121 bp。且蛋白一级结构的预测也表明这两个植株的蛋白已经被破坏掉。其次,在原有的四种突变体aox1a,aox1c,aox1d和aox2的基础上,通过杂交技术,得到了不同基因型的双突、三突、四突,然后再通过CRISPR获得五突,目前五突的鉴定还在进行中。最后对这些突变体做了盐胁迫和干旱胁迫条件下的表型观察分析。结果表明干旱胁迫对突变体植物的影响不大,但是突变体对盐胁迫比较敏感,盐处理在一定程度上会影响植物的生长状态,且盐处理后双突和四突突变体内过氧化氢含量明显增加,而其他指标没有受到明显的影响。但是对突变体的表型分析只做了一部分,有的处理考虑的条件还不是很合理,该部分还需要继续深入研究。而抗霉素A阻断细胞色素途径的实验表明,在AOX途径中起主要作用的基因是AOX1a,且在AOX基因中可能存在功能冗余的现象。本实验中各种突变体材料的获得以及目前胁迫方面的研究都为后续的实验提供了方便,有利于以后对AOX功能机制的进一步了解。