黄杞叶醇提物生物活性研究及功能性食品开发

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黄杞叶为胡桃科黄杞属植物黄杞(Engelhardtia roxburghiana wall.)的干燥叶,含有丰富的类黄酮和多酚类物质,具有抗炎、抗氧化、抗血栓、免疫调节等多种生理活性。落新妇苷为黄杞叶(ERW)中主要活性成分,具有抗炎、免疫抑制、保肝护肾、镇痛、抑菌、降血糖等活性。但目前对黄杞叶有效成分提取、活性研究和产品开发等方面的系统研究缺乏,相关技术储备对黄杞产业的综合开发支撑度不足。基于此,本文以黄杞叶为研究对象,建立了液相色谱检测黄杞叶中落新妇苷含量的方法,优化黄杞叶醇提物(E-ERW)提取工艺,并鉴定其中主要组分,最后研究E-ERW抗氧化、抗菌和降糖等生物活性;在此基础上研究与开发黄杞叶生物医药相关产品,为实现黄杞产业附加值提升以及种植户增收提供坚实的技术保障。(1)响应面法优化微波及超声提取黄杞叶中落新妇苷工艺利用响应面法分别优化了微波法和超声法提取黄杞叶中落新妇苷工艺;通过方法学考察,建立了液相色谱检测落新妇苷的色谱条件;并对E-ERW组分进行UHPLC-MS分析以及测定ERW中总黄酮和总酚含量。结果表明,采用微波法提取E-ERW最优工艺条件为:乙醇浓度55%、微波温度49℃、微波时间57 s,在该条件下的预测落新妇苷收率为9.209%,实测值为9.215±0.15%;采用超声法提取E-ERW最优工艺条件为:料液比1:18、乙醇浓度60%、超声时间56 min,在该条件下的预测落新妇苷收率为9.05%,实测值为8.963±0.12%;综上,根据落新妇苷收率、时间成本及操作复杂程度确定最佳提取落新妇苷方法为微波法,工艺条件为乙醇浓度55%、微波温度50℃、微波时间57 s。通过UHPLC-MS鉴定出20种化合物,主要为落新妇苷、二氢槲皮素、槲皮素及黄杞苷,另外还有柠檬酸、苹果酸等有机酸。含量测定结果表明ERW中含丰富的总黄酮和总酚,含量分别为153.42±2.74 mg QE/g、255.74±4.16 mg GAE/g。(2)黄杞叶醇提物抗氧化活性研究通过对DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力以及还原能力和抗脂质膜氧化能力考察了E-ERW和落新妇苷的抗氧化活性。结果表明,在0.2~1 mg/m L浓度范围内,E-ERW对DPPH和ABTS+自由基清除率分别高达78.83%和77.5%,落新妇苷对二者清除率最高可达70.38%和61.51%,活性弱于醇提物和维生素C;对于还原能力,E-ERW吸光值在0.548~1.505之间,落新妇苷在0.264~1.005之间,且二者均低于维生素C;对于抗脂质膜氧化,E-ERW对脂质膜抑制率达95.01%,在浓度大于0.8 mg/m L时,其抗脂质膜氧化能力与阳性对照组(单宁酸)之间无显著性差异,效果相当。而落新妇苷整个实验浓度范围内的抗脂质膜氧化率均在20%以下,抗脂质膜氧化能力不显著。提示E-ERW中的落新妇苷与其他活性成分之间可能存在联合效应共同发挥抗氧化作用。(3)黄杞叶醇提物抑菌活性研究采用琼脂扩散法和二倍稀释法考察了E-ERW和落新妇苷对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)及大肠杆菌(E.coli)的抑菌活性。结果表明,100 mg/m L E-ERW对S.aureus、B.subtilis和E.coli的抑菌圈直径分别为12.20±0.44、15.37±0.38、16.91±0.17 mm,MIC分别为6.25、0.781、0.391 mg/m L,MBC值分别为12.5、3.125、1.563 mg/m L。E-ERW对S.aureus敏感度为中敏,对B.subtilis和E.coli敏感度为高敏,抑菌强弱顺序为E.coli>B.subtilis>S.aureus。落新妇苷对三种菌均显示出一定的抑菌活性,抑菌圈直径分别为12.41±0.13、11.94±31、11.02±0.36 mm,敏感度均为中敏。落新妇苷对S.aureus的抑菌活性优于E.coli,这与E-ERW对两种菌的活性强弱是相反的。(4)黄杞叶醇提物降血糖活性研究通过研究E-ERW和落新妇苷抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性,并分析E-ERW对两种酶抑制动力学及与两种酶之间的相互作用,初步考察E-ERW和落新妇苷体外降血糖活性;通过灌胃E-ERW对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠进行治疗,并分析糖尿病小鼠血糖、体重、饮水、排泄量、口服葡萄糖耐量、胰岛素、血清指数及脏器指数等指标变化,考察其体内降血糖活性。结果表明,E-ERW对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的半抑制浓度IC50分别为0.461、0.859 mg/m L,抑制效果优于落新妇苷;E-ERW对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制类型均为混合型抑制类型,抑制常数Ki值分别为0.145、0.355 mg/m L;E-ERW与α-葡萄糖苷酶之间相互作用方式为动态猝灭,与α-淀粉酶之间为混合猝灭方式,猝灭常数Kq分别为3.546×10~9、4.804×10~9。落新妇苷对α-葡萄糖苷酶抑制类型为混合型抑制,对α-淀粉酶抑制类型为非竞争型抑制,落新妇苷与两种酶之间作用机制均为混合猝灭。E-ERW可以显著降低由四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖水平(p<0.05),提高小鼠体内胰岛素含量;由E-ERW高剂量治疗的小鼠,具有更强的葡萄糖耐量,AUC值下降了32.95%;同时E-ERW高剂量组、中剂量组、落新妇苷组可显著降低甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白(LDL-c)含量,并能升高高密度脂蛋白(HDL-c)含量(p<0.05),可明显降低糖尿病小鼠血脂,并能显著降低糖尿病小鼠肝体比和肾体比(p<0.05),缓解糖尿病小鼠肝脏和肾脏周围脂肪堆积情况。(5)黄杞叶醇提物泡腾片研究与开发基于E-ERW降血糖活性,研究开发辅助降血糖的黄杞叶醇提物泡腾片。泡腾片最优处方为:5%E-ERW、0.3%木糖醇、20%富马酸、40%碳酸氢钠、30.9%乳糖、3%PEG6000、0.3%硬脂酸镁和0.5%柠檬酸,通过直接压片法制备泡腾片。根据最优处方制备的黄杞叶醇提物泡腾片质量评定结果为:泡腾片表面光滑整洁,形状完整,呈浅棕色,平均片重0.813 g,质量差异2.51%,硬度70.39 N,休止角24.7°,崩解时限144.5 s,起泡量28.7 m L,p H5.77。
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