目的:运用脑微血管内皮细胞膜固相色谱法筛选补阳还五汤中与脑微血管内皮细胞膜具有较高亲和性的活性成分,经化学结构鉴定、药理验证,探讨其“生新”作用机制。方法:1.补阳还五汤提取液指纹图谱及含量测定方法的建立运用反相高效液相色谱法建立补阳还五汤提取液指纹图谱,同时测定补阳还五汤提取液中毛蕊异黄酮苷、阿魏酸、芒柄花苷和羟基红花黄色素A的含量,以控制补阳还五汤提取液的质量。2.原代脑微血管内皮细胞的分离鉴定参考文献方法,从10日龄大鼠脑组织中分离获得原代脑微血管内皮细胞,培养传代,观察细胞形态,免疫荧光染色法检查细胞纯度。3.脑微血管内皮细胞膜固相色谱法的建立采用固相萃取技术对样品进行前处理,分别考察了不同填料SPE柱、不同洗脱程序对补阳还五汤提取液中各共有峰回收率的影响,并确定细胞最适宜的给药浓度非特异性结合成分的洗涤次数,以建立脑微血管内皮细胞固相色谱方法。采用LC-MS技术对细胞膜固相色谱法获得的解离液中成分进行鉴定,对获取的二级谱图信息与文献匹配,确定筛选的结合成分分子式。运用CCK-8实验验证其亲和性成分对氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞的保护作用。4.活性成分对氧糖剥夺模型细胞VEGF和bFGF分泌的影响采用ELISA法考察活性成分对氧糖剥夺模型细胞VEGF和bFGF表达的影响,探讨活性成分促进血管新生的作用机制。结果:1.补阳还五汤指纹图谱及含量测定结果建立的指纹图谱方法具有较好的专属性、精密度和稳定性,通过相似度评价系统对制备的10批提取液样品进行相似度拟合,确定了 1 8个共有峰,且相似度结果表明10批样品的相似度均高于0.9,可用于提取液样品的质量控制。建立的方法具有专属性、精密度、稳定性及准确性符合含量测定的要求,10批提取液中各成分含量结果如下:毛蕊异黄酮苷含量分别为90.180～114.799 μg/mL;阿魏酸含量为:25.637～42.973μg/mL;芒柄花苷含量分别为12.193～19.845 μg/mL;羟基红花黄色素A的含量为132.097～181.284 μg/mL。2.原代脑微血管内皮细胞的分离鉴定分离的原代脑微血管内皮细胞细胞在倒置显微镜下呈长梭型,细胞融合后呈现明显的“漩涡”状及内皮细胞典型的“铺路石”特征。免疫荧光染色鉴定纯度为95%。3.脑微血管内皮细胞膜固相色谱法的建立确定以STRATA-X型固相柱,洗脱方法为:甲醇平衡后超纯水活化,上样后超纯水清洗,50%乙腈水溶液洗脱。所建立的方法操作简便,且对各共有峰均具有较高的回收率,可用于细胞膜固相色谱法中细胞洗涤液及细胞解离液样品的纯化和富集。以细胞给药浓度为55mg/mL,洗涤次数为5次,建立脑微血管内皮细胞膜固相色谱方法根据解离液液相分析结果,明确补阳还五汤中有六个成分特异性与脑微血管内皮细胞膜发生结合。进一步的质谱分析,结果表明六个结合成分分别为毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芒柄花苷、没食子酰芍药苷、7-2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、6-羟基山奈酚-3,6-二-O-葡萄糖苷。CCK-8实验结果表明,氧糖剥夺再灌注模型组细胞活性较正常组细胞显著性降低(P<0.01);VEGF组较模型组细胞存活率显著提高(P<0.01);毛蕊异黄酮苷在1～20μg/mL浓度范围内能显著增强氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞存活率(P<0.01);芍药苷在1～40μg/mL浓度范围内能显著增强氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞存活率(P<0.01);芒柄花苷在0.1～20μg/mL浓度范围内能显著增强氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞存活率(P<0.01);没食子酰芍药苷在1～20μg/mL浓度范围内能显著增强氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞存活率(P<0.01);7-2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷在0.5～40μg/mL浓度范围内能显著增强氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞存活率(P<0.05,P<0.01);6-羟基山奈酚-3,6-二-O-葡萄糖苷在0.5～40μg/mL浓度范围内对缺氧复氧损伤脑微血管内皮细胞活性无明显的增强作用(P>0.05)。4.活性成分对氧糖剥夺模型细胞VEGF和bFGF分泌的影响模型组VEGF表达较正常组显著增强(P<0.01);与模型组比较,不同浓度的毛蕊异黄酮苷,芍药苷,芒柄花苷和没食子酰芍药苷处理后,VEGF的表达显着增加(P<0.05,P<0.01)。对于7,2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄酮,低、中浓度组中VEGF的表达无显著性差异(P>0.05),但高浓度组较模型组显著升高(P<0.05)。与模型组比较,不同浓度的毛蕊异黄酮苷,芍药苷,芒柄花苷和没食子酰芍药苷处理后,bFGF的表达显着增加(P<0.05,P<0.01)。对于7,2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄酮,低浓度组中bFGF的表达无显著性差异(P>0.05),但中高浓度组的VEGF表达较模型组明显升高(P<0.05)。结论:建立的指纹图谱及含量测定方法符合要求,可用于补阳还五汤提取液的质量控制;分离的原代脑微血管内皮纯度较高,可用于细胞膜固相色谱实验;建立的脑微血管内皮细胞膜固相色谱法筛选出六个个结合成分,药效验证确定毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芒柄花苷、没食子酰芍药苷、7-2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷在合适浓度范围内对氧糖剥夺再灌注损伤脑微血管内皮细胞均具有一定程度的保护作用,为补阳还五汤中有效成分;五个有效成分均能不同程度上调VEGF和bFGF的水平,提示有效成分可能通过上调氧糖剥夺模型脑微血管内皮细胞VEGF和bFGF水平发挥促进血管新生作用。