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平阳霉素是由轮枝链霉菌产生的糖肽类抗生素,用于抗肿瘤治疗。但目前国内工业发酵水平较低,本课题主要通过菌种选育和发酵条件优化以提高平阳霉素的产量。以本实验室保存的SIPI-PY-01为出发菌株,经自然分离、抗亚精胺筛选、紫外诱变筛选后,得到一株稳定且高产的白色孢子菌SIPI-PY-UV38,单位较出发菌株提高45.2%。
在摇瓶发酵条件探究中,首先探究种子摇瓶的培养温度和转速,结果证明种子培养温度为28℃和培养转速为240rpm时最佳,并绘制种子生长曲线以供后期实验参考。在上述基础上通过探究平阳霉素发酵摇瓶的温度、pH、转速、接种量、装液量等基本参数的研究,并且分别进行碳氮源、无机盐及氨基酸的添加实验,为节省生产成本,筛选获得宁夏枸杞嫩芽作为亚精胺替代物,最优配方为玉米浆22.5g/L,玉米淀粉(α-淀粉酶糊化)30g/L,麦芽糊精40g/L,葡萄糖5g/L,冷榨黄豆饼粉18g/L,花生饼粉12g/L,麸质粉20g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸锌0.5g/L,五水合硫酸铜0.1g/L,硝酸钠2.0g/L,柠檬酸铵1.2g/L,甲硫氨酸1.2g/L,宁夏枸杞嫩叶8g/L,pH6.8,发酵温度为29℃,接种量为2mL,装液量为35mL/250mL,平阳霉素单位为27.69μg/mL。
在25L发酵罐中,通过上述平阳霉素摇瓶发酵参数的放大,直接引用于罐发酵工艺当中。由于罐发酵状态与摇瓶发酵生长代谢有很大差异,本实验通过接种量、碳氮源流加方案的初步探究,获取基本罐发酵参数为:发酵罐培养基:玉米浆22.5g/L,玉米淀粉(α-淀粉酶糊化)15g/L,麦芽糊精20g/L,葡糖糖10g/L,冷榨黄豆饼粉18g/L,花生饼粉12g/L,麸质粉20g/L,宁夏枸杞嫩叶16g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸锌0.5g/L,五水合硫酸铜0.1g/L,硝酸钠2.0g/L,柠檬酸铵1.2g/L,甲硫氨酸1.2g/L,泡敌0.6g/L,硅油0.4g/L,计料7L,加水7L,pH6.8,121℃蒸汽灭菌30分钟。碳源流加配方:玉米淀粉(α-淀粉酶糊化)7.5%,麦芽糊精10%液体配制。日补碳源量为75g。氮源补料配方:玉米浆7.0g/L,冷榨黄豆饼粉24g/L,花生饼粉22g/L,麸质粉25g/L,宁夏枸杞嫩叶32g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸锌0.5g/L,五水合硫酸铜0.1g/L,硝酸钠2.0g/L,柠檬酸铵1.2g/L,甲硫氨酸1.2g/L,泡敌0.8g/L,硅油0.6g/L,pH自然。补料量为400mL/25L,补料次数为2次/天。平阳霉素的产量达到45.3μg/mL。
本实验创新点在于首次引入植物药作为发酵原料替代亚精胺,同时作为氮源和碳源能够提供菌丝体生长,在成本和产率上均有突破,且符合环保要求。
在摇瓶发酵条件探究中,首先探究种子摇瓶的培养温度和转速,结果证明种子培养温度为28℃和培养转速为240rpm时最佳,并绘制种子生长曲线以供后期实验参考。在上述基础上通过探究平阳霉素发酵摇瓶的温度、pH、转速、接种量、装液量等基本参数的研究,并且分别进行碳氮源、无机盐及氨基酸的添加实验,为节省生产成本,筛选获得宁夏枸杞嫩芽作为亚精胺替代物,最优配方为玉米浆22.5g/L,玉米淀粉(α-淀粉酶糊化)30g/L,麦芽糊精40g/L,葡萄糖5g/L,冷榨黄豆饼粉18g/L,花生饼粉12g/L,麸质粉20g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸锌0.5g/L,五水合硫酸铜0.1g/L,硝酸钠2.0g/L,柠檬酸铵1.2g/L,甲硫氨酸1.2g/L,宁夏枸杞嫩叶8g/L,pH6.8,发酵温度为29℃,接种量为2mL,装液量为35mL/250mL,平阳霉素单位为27.69μg/mL。
在25L发酵罐中,通过上述平阳霉素摇瓶发酵参数的放大,直接引用于罐发酵工艺当中。由于罐发酵状态与摇瓶发酵生长代谢有很大差异,本实验通过接种量、碳氮源流加方案的初步探究,获取基本罐发酵参数为:发酵罐培养基:玉米浆22.5g/L,玉米淀粉(α-淀粉酶糊化)15g/L,麦芽糊精20g/L,葡糖糖10g/L,冷榨黄豆饼粉18g/L,花生饼粉12g/L,麸质粉20g/L,宁夏枸杞嫩叶16g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸锌0.5g/L,五水合硫酸铜0.1g/L,硝酸钠2.0g/L,柠檬酸铵1.2g/L,甲硫氨酸1.2g/L,泡敌0.6g/L,硅油0.4g/L,计料7L,加水7L,pH6.8,121℃蒸汽灭菌30分钟。碳源流加配方:玉米淀粉(α-淀粉酶糊化)7.5%,麦芽糊精10%液体配制。日补碳源量为75g。氮源补料配方:玉米浆7.0g/L,冷榨黄豆饼粉24g/L,花生饼粉22g/L,麸质粉25g/L,宁夏枸杞嫩叶32g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,七水合硫酸锌0.5g/L,五水合硫酸铜0.1g/L,硝酸钠2.0g/L,柠檬酸铵1.2g/L,甲硫氨酸1.2g/L,泡敌0.8g/L,硅油0.6g/L,pH自然。补料量为400mL/25L,补料次数为2次/天。平阳霉素的产量达到45.3μg/mL。
本实验创新点在于首次引入植物药作为发酵原料替代亚精胺,同时作为氮源和碳源能够提供菌丝体生长,在成本和产率上均有突破,且符合环保要求。