自噬(autophagy)是一种高度保守的细胞内自我代谢机制,通过溶酶体途径降解受损细胞器(例如内质网,高尔基和线粒体等)和长寿命蛋白,达到细胞内氨基酸等原料的回收、循环再利用,从而保证细胞内环境的稳态和细胞的完整性。自噬可以在多种应激(Stress)条件下激活,如饥饿,乏氧,活性氧(reactive oxygen species,ROS)和电离辐射(ionizing radiation,IR)。自噬在肿瘤发生、发展和治疗等过程中发挥重要作用,并且是“双向作用”:一方面自噬在一定条件下促进肿瘤细胞存活抵抗肿瘤治疗;另一方面自噬也可以促进肿瘤细胞发生程序性细胞死亡而增加肿瘤治疗敏感性。其作用的差异主要取决于肿瘤遗传背景或治疗方案的差异。个体化和精准化治疗是当前和以后肿瘤治疗的趋势,明确自噬在肿瘤治疗过程中发挥的作用和机制将有利于指导临床肿瘤个体化和精准化治疗方案的制定。共济失调毛细血管扩张突变蛋白(The protein kinase ataxia-telangiectasia mutated,ATM)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于PI3K家族,其磷酸化区域是疏水性[S/T]-Q。ATM主要功能是最早识别DNA双链断裂,然后磷酸化其下游靶基因进而调控DNA损伤修复,以及细胞凋亡和细胞周期等重要细胞活动。最近发现ATM参与调控多种遗传毒性和氧化应激诱导的自噬,但是ATM在IR诱导自噬中的功能和机制未见报道。近年来,蛋白质组学相关结果发现电离辐射(IR)诱导DNA损伤后,MAPK14与ATM共享同一个磷酸化位点:TQ263。丝裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase14,MAPK14)属于应激激活蛋白激酶,是丝氨酸/苏氨酸定向激酶,可被多种细胞外刺激激活,参与调控多种重要细胞活动,例如细胞存活,分化和细胞增殖。MAPK14对自噬具有双重调控作用:一方面,MAPK14长期失活激活AMPK信号通路进而激活自噬;另一方面,MAPK14可以在转录水平上促进自噬相关基因的表达。然而迄今为止,ATM对MAPK14的调控关系及作用机制,尤其在IR诱导自噬中的作用机制未见报道。目的:本研究旨在探讨ATM-MAPK14在IR诱导肿瘤细胞发生自噬的作用和机制,为丰富辐射实验肿瘤学理论并为肿瘤的基因靶向治疗提供依据。方法:1选用人宫颈癌细胞株Hela和肺癌细胞株H1299为研究对象;2采用基因工程方法构建ATM及MAPK14沉默载体,并建立相应稳定表达的沉默细胞模型;3使用深部X射线治疗机照射细胞,条件:电压180k V,电流18.0m A,滤板0.25mm Cu和1.0mm Al,靶皮距60cm,剂量率0.40 Gy·min–1;4CCK8(cell counting Kit-8)和集落形成方法检测细胞存活及细胞辐射敏感性;5GFP-LC3细胞模型和MDC染色检测自噬通量(autophagy flux);6Western blot检测蛋白表达水平变化;7免疫共沉淀(IP)检测蛋白间相互作用;8流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果:1.IR诱导自噬和ATM Ser1981位点的磷酸化经过8Gy IR诱导Hela细胞和H1299细胞,Western blot结果显示,MAPLC3-II/MAPLC3-I比值呈剂量依赖性(0Gy,2Gy,4Gy和8Gy)和时间依赖性(4h,8h,16h和24h)增加,其中8Gy IR后16-24h比值最高;Hela和H1299细胞构建GFP-LC3细胞模型,8Gy IR诱导后,细胞中可见明显的自噬空泡;Hela细胞和H1299细胞分别经8Gy IR诱导后,MDC方法检测自噬阳性细胞率分别从17.32%增加到54.77%和7.83%增加到25.93%。以上三种实验结果共同提示IR诱导Hela细胞和H1299细胞自噬激活。同时,Western blot结果显示:与假照组相比,ATM Ser1981位点的磷酸化在8Gy IR后30min迅速达到最高水平,4h恢复到基础水平。2.抑制ATM下调MAPK14表达进而抑制MAPKAPK2磷酸化在Hela细胞和H1299细胞中构建ATM和MAPK14沉默细胞模型。通过western blot验证,沉默ATM后,MAPK14表达水平下调,但沉默MAPK14不影响ATM表达水平。同时在H1299细胞中,沉默MAPK14明显下调其下游靶基因MAPKAPK2表达水平。提示MAPK14很可能是ATM下游靶基因之一。另外,ATM抑制剂KU55933在抑制ATM磷酸化的同时使MAPKAPK2磷酸化水平显著下降。提示ATM调控MAPK14-MAPKAPK2信号通路。3.抑制ATM和MAPK14增加辐射敏感性不同剂量IR处理Hela细胞和H1299细胞前2h,分别给予用ATM磷酸化抑制剂KU55933 100n M和700n M预处理,集落形成检测细胞辐射敏感性。与DMSO对照组相比,KU55933预处理的Hela细胞和H1299细胞D0分别为3.59 vs 3.02和2.21 vs 1.59,D0值均明显降低。Hela和H1299细胞的ATMRi和MAPK14Ri细胞模型经过不同剂量IR处理,集落形成检测细胞辐射敏感性。与Psuper空载体组比较,D0值分别降低(Hela-ATMRi:2.77 vs 2.13;Hela-MAPK14Ri:2.77 vs 2.19;H1299-ATMRi:2.07 vs 1.44;H1299-MAPK14Ri:2.07 vs 1.52)。以上结果提示,抑制ATM或MAPK14增加辐射敏感性,且两者可能处在调控辐射敏感性的同一个通路。4.抑制ATM和MAPK14不影响IR诱导的凋亡与假照组相比,Hela和H1299沉默细胞模型经8Gy IR处理后24h检测通过流式细胞术检测凋亡水平,空载体Psuper组、ATMRi组和MAPK14Ri组细胞中,凋亡水平均有所增加,分别为8.61%vs 12.5%、8.57%vs 14.08%、9.26%vs 13.88%和6.1%vs 10.2%,5.1%vs 11.8%,5.3%vs 9.8%,但三组之间凋亡水平的增加程度没有差异,提示沉默ATM和MAPK14并没有影响IR诱导的凋亡。5.抑制ATM和MAPK14降低Hela细胞中IR诱导的自噬水平首先在Hela细胞中检测KU55933对IR诱导自噬的影响。经8Gy IR处理后24h,Western blot检测蛋白表达水平,灰度分析并计算MAPLC3II/MAPLC3I比值。DMSO对照组MAPLC3II/MAPLC3I比值呈剂量依赖性增加(0Gy:1.00,2Gy:1.46,4Gy:1.36和8Gy:1.93),而100n M KU55933提前2h预处理后各组MAPLC3II/MAPLC3I比值(0Gy:1.92,2Gy:2.05,4Gy:2.08和8Gy:1.40)无明显增加。与DMSO组细胞比较,单独KU55933处理使基础MAPLC3比值增加(1.00 vs 1.92),但8Gy IR联合KU55933处理使MAPKLC3比值降低(1.92vs 1.40);同时,在GFP-LC3细胞模型中,8Gy IR使DMSO对照组含自噬空泡阳性细胞率增加了124%,而经KU55933预处理后仅增加了34.2%;另外,MDC方法检测自噬阳性细胞率得到类似的结果(202%vs 35.72%)。三种结果共同提示KU55933抑制ATM磷酸化后,抑制Hela细胞中IR诱导自噬的水平。然后在Hela沉默细胞模型中进一步验证ATM和MAPK14的作用。8Gy IR诱导后24h,Western blot检测蛋白水平变化。与假照组相比,空载体Psuper组、ATMRi组、MAPK14Ri组细胞中MAPLC3II/MAPLC3I比值分别为1.00 vs 2.71、0.75 vs 0.81和1.19 vs 0.91;同时,MDC阳性细胞率分别增加了为272%,53.18%和24.76%。以上结果表明沉默ATM和沉默MAPK14均可抑制Hela细胞中IR诱导的自噬水平。6.抑制ATM和MAPK14降低H1299细胞中IR诱导的自噬水平在H1299细胞中检测KU55933对IR诱导自噬的影响。一方面,在GFP-LC3细胞模型中,8Gy IR使DMSO对照组细胞含自噬空泡阳性细胞率增加了129%,经700n M KU55933预处理后仅增加了29.22%;另一方面,MDC染色结果显示,8Gy IR使DMSO对照组MDC阳性细胞率增加了231%,经700n M KU55933预处理后仅增加了24%。提示KU55933抑制ATM磷酸化后,抑制H1299细胞中IR诱导的自噬水平。在H1299沉默细胞模型中,8Gy IR诱导后24h,Western blot检测蛋白水平变化。与假照组相比,空载体Psuper组、ATMRi组、MAPK14Ri组细胞中MAPLC3II/MAPLC3I比值分别为1.00 vs 2.07、0.91 vs 0.84和2.30 vs 0.65;另外,MDC染色结果显示,8Gy IR使三组细胞中MDC阳性细胞率分别增加了136%,27%和-55%。表明沉默ATM抑制H1299细胞中IR诱导的自噬水平,虽然沉默MAPK14增加H1299的基础自噬水平,但是8Gy IR诱导后其自噬水平下降。提示沉默ATM和沉默MAPK14均可抑制H1299细胞中IR诱导的自噬水平。7.抑制ATM和MAPK14减弱IR对m TOR信号通路的抑制作用与假照组相比,8Gy IR处理Hela细胞后,AKT,P-m TOR和P-P70S6K表达水平分别下降46%,59%和58%,经100n M KU55933预处理后,各基因表达水平分别下降36%,28%和21%。Hela沉默细胞模型中,与假照组相比,8Gy IR使Psuper空载体细胞中P-P70S6K/T-P70S6K下降(1.00 vs 0.43),却对ATMRi细胞(0.43 vs 0.34)和MAPK14Ri细胞(0.32 vs 0.33)的m TOR信号通路活性没有影响。提示KU55933抑制ATM磷酸化,沉默ATM基因和沉默MAPK14基因可以部分解除Hela细胞中IR对m TOR信号通路活性的抑制。与假照组相比,8Gy IR处理H1299细胞后,AKT,P-m TOR和P-P70S6K表达水平分别下降50%,84%和70%,经700n M KU55933预处理后,各基因分别下降了10%,40%和38%。H1299沉默细胞模型中,与假照组相比,8Gy IR使Psuper空载体细胞m TOR表达水平下降62%,却没有改变ATMRi细胞的m TOR水平。重要的是,MAPK14Ri细胞中m TOR基础水平较低,为空载体对照组的0.3倍,而8Gy IR使其显著增加至0.7倍,该变化与H1299细胞中MAPLC3的变化趋势一致。表明KU5593抑制ATM磷酸化,沉默ATM基因和沉默MAPK14基因可以部分减弱H1299细胞中IR对m TOR信号通路的抑制作用。两种细胞中结果共同提示ATM和MAPK14可能通过m TOR信号通路直接调控IR诱导的自噬。8.抑制ATM和MAPK14影响Beclin 1/PI3KIII复合物Hela细胞中,8Gy IR使空载体对照组细胞Beclin 1/PI3KIII结合增加1.63倍,而在ATMRi细胞(2.93 vs 1.36)和MAPK14Ri细胞(1.99 vs 1.09)中IR使该结合水平下降。同时,在空载体细胞中检测到Beclin 1/ATM的结合,沉默ATM和MAPK14后该结合消失。另外,8Gy IR使空载体细胞中MAPK14/BCL2结合水平和MAPK14/Beclin1结合水平增加,而沉默ATM和MAPK14基因后两种结合作用分别下降和不变。提示ATM和MAPK14可能通过影响Beclin 1/PI3KIII复合物参与调控IR诱导的自噬。H1299细胞中,8Gy IR使Beclin 1/PI3KIII结合增加29.05倍,而700n M KU55933预处理后,8Gy IR不再增加Beclin 1/PI3KIII结合。另外,在空载体细胞中发现Beclin1/P-MAPKAPK2的结合,但IR不能改变二者结合水平。而沉默ATM后IR使该结合水平显著下降,沉默MAPK14后二者结合消失。Beclin1/T-MAPKAPK2结合水平也发生类似变化。进一步提示ATM和MAPK14可能通过调控Beclin 1/PI3KIII复合物增加IR诱导的自噬。结论:1.IR诱导Hela细胞和H1299细胞发生自噬及活化ATM。2.MAPK14是ATM下游底物之一。3.沉默ATM-MAPK14通路抑制IR诱导的自噬。4.沉默ATM-MAPK14通路减弱IR对m TOR通路的抑制作用从而降低IR诱导的自噬。5.沉默ATM-MAPK14通路影响Beclin1/PI3KIII复合物活性从而降低IR诱导的自噬。6.ATM-MAPK14通路通过m TOR信号通路和Beclin1/PI3KIII复合物调控IR诱导的自噬最终影响肿瘤细胞放疗敏感性。