用各种自体肌腱移植物替代重建前交叉韧带即使经过比较长的时间移植物和宿主之间也很难完全愈合,仍然存在自体肌腱移植物松弛和断裂的严重并发症。无论是采用自体还是异体移植物,在重建术后其愈合和再塑形过程都基本相似,都要经历移植物坏死、细胞重新移居、血管重建和再塑形四个阶段。取半腱肌腱后观察其再生时间,组织学及免疫组化结果证实,再生组织的确为新生肌腱,因其具有正常的腱细胞形态和腱组织结构,且主要成分由Ⅰ型胶原组成。虽然新生肌腱具有正常的组织结构,但氨基葡聚糖和胶原的含量显著低于正常腱组织,肌-腱连接处细胞排列紊乱无序,其直径也明显小于对侧肌腱。虽然再生腱组织能够将外力传导通过肌-腱连接处,但其传导速率明显低于正常,最大抗牵拉力也只有正常的32%,生物学功能方面明显弱于正常肌腱。研究表明,局部应用外源性细胞因子,可明显增加韧带的强度、刚度和抗拉断能量。但由于细胞因子多为高分子蛋白,在生物内环境代谢快,生物利用度低,且有一定的免疫原性,这些缺点防碍了它在体内的局部应用。基因质粒使细胞因子以DNA的形式储存在载体中,不易受各类蛋白酶的水解,更稳定,免疫原性更低,疗效也更持久,可以在内环境中持续高水平地表达数周之久。传统的基因转染方法主要是将宿主体内的种子细胞取样在体外培养一段时间,适当地传代后与目标基因在体外转染然后再回植体内,其工艺步骤,经济代价高昂,而且操作周期过长,不适合韧带急性损伤修复的病理特点。近年来,一些提出“原位组织工程”的概念作为可能的解决方案,并且已成为基因治疗和组织工程的一个重要研究方向。原位组织工程的基本理念是将生物材料与质粒DNA相结合,形成一个基因局部释放系统,即“基因活化基质”(gene activated matrix,GAM),将该基质材料植入组织缺损处,当内源细胞爬入后,细胞被质粒转染,分泌质粒编码的组织修复蛋白因子,成为体内局部生物反应器,从而促进组织的重建,这种载有质粒DNA的生物材料,也被称之为“局部基因释放载体”(local gene delivery carrier)。作者认为采用基因活化基质技术,通过较长期的动物实验比较,从组织形态学和生物力学水平评价不同处理自体移植物的愈合转归,可为寻找优化自体移植肌腱韧带化的生物学新方法提供研究资料,从而降低前交叉韧带重建术后自体移植物松弛断裂的发生率,提高手术疗效。目的1、探讨真核表达载体EGFP-N1-TGF-β1在成纤维细胞(GF)中的表达能力。2、完成兔前交叉韧带重建动物模型的构建及鉴定,了解GAM材料应用于动物模型后各时段肌腱移植物愈合的实际效能。3、了解两组动物移植物愈合过程中的组织学形态变化,比较其胶原表达情况和细胞超显微结构的差异性。方法1、应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定EGFP-N1-TGF-β1真核表达载体,体外培养兔成纤维细胞,传代培养后以阳离子脂质体：EGFP-N1-hTGF-β1为3μL：1μg的比例转染,G418筛选获得稳定转染的细胞。通过RT-PCR和荧光法检测TGF-βl表达水平；利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF-β1的生物学活性。2、将新西兰大白兔48只随机分为两组,试验动物中,移植物与GAM材料作用者为实验组(A组),移植物未作处理者为对照组(B组),每组动物样本数24例。手术切除实验动物的前交叉韧带,制作胫骨及股骨隧道,取自体半腱肌作为肌腱移植物,引入骨隧道,两端缝合固定,完成前交叉韧带重建。术后1月、3月、6月分别处死动物取材。收获肌腱标本,大体观察肌腱移植物的形态,标本用于生物力学测试,记录最大断裂负荷(负荷峰值)、断裂时拉伸位移,应力、应变及弹性模量,并作出以上数据随时间变化的关系图谱。3、制备膝关节前交叉韧带重建模型,实验组给予生长因子,对照组给予盐水,分别于术后1个月,3个月和6个月,将韧带移植物取出,通过光学显微镜和电镜进行肌腱组织学检查,观察其胶原表达和细胞超微结构的变化。结果1、成功构建含EGFP-N1-TGF-β1基因的真核表达载体,经RT-PCR检测了TGF-β1在转录水平mRNA的表达情况,荧光法检测目标基因成功转染至靶细胞,转染后的成纤维细胞呈强阳性表达,并持续4周以上,转染后细胞上清可有效的抑制水貂肺上皮细胞的生长。2、术后存活的动物,收获标本时大体观察无变异,仅发现对照组移植物断裂1例,实验组组未发现移植物断裂,移植物的总体成功率为97.9%。在术后1个月时间段内,实验组与对照组的各项力学指标差异无显著性,在术后3个月和6个月时,实验组肌腱标本的最大断裂负荷及弹性模量显著大于对照组,p≤0.05,此时间段内各组的其它力学指标差异无显著性。3、光学显微镜下见各时期对照组成纤维细胞数量较少且胶原纤维排列紊乱,实验组成纤维细胞数量较多,胶原纤维成分增多,形状粗大且排列较规则,接近正常组织结构。电镜下见实验组各时期实验组的细胞内微结构较对照组有丝分裂活跃,出现代谢旺盛的成纤维细胞,纤维间隙内有较多基质成分,胞质中可见较为丰富的内质网和线粒体。结论1、重组真核表达载体构建正确,并能在成纤维细胞中表达TGF-β1mRNA,TGF-βl基因转染可使成纤维细胞有效而稳定的表达活性TGF-β1而产生生物效应。2、本实验构建兔前交叉韧带重建动物模型的手术方法与临床实际情况相符,术后证实有很高的成功率,可用于前交叉韧带愈合机制的实验研究。GAM材料局部作用于肌腱移植物后,某些生物力学特性强于对照组,可提高目标肌腱的愈合强度。3、转化生长因子转染的韧带移植物组织结构愈合比对照组好,转化生长因子对韧带的愈合有促进作用,本实验为前交叉韧带损伤基础研究及临床治疗提供理论依据。