骨形态发生蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7，BMP-7）又名成骨蛋白-1（Osteogenic Protein，OP-1），属于转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，调节多种细胞的生长、分化及调亡。研究发现BMP-7不仅具有骨诱导作用，而且在促进肾脏发育、维持肾脏正常生理功能等方面发挥着重要的作用。 目前市场上已经有rhBMP-7埋植剂和rhBMP-7泥灰两种剂型，分别用于治疗骨缺损和脊柱修补。但是rhBMP-7的溶解度小，易生成沉淀，阻碍了rhBMP-7注射剂型的开发和临床应用。 目前临床使用的rhBMP-7均为真核细胞表达。真核表达的rhBMP-7表达量低，成本高，价格昂贵，限制了其在临床上的应用。用而采用原核系统表达rhBMP-7具有操作简单、基因稳定、表达量高的优点，缺点是不能进行翻译后修饰，需要经过复性工艺处理。本实验室前期对原核系统表达rhBMP-7已经进行了充分的研究，发现其经过纯化复性后具有良好的骨诱导活性。目前，临床上尚没有治疗肾衰的特效药物，而已有的研究证实BMP-7在多种肾病动物模型能够抑制纤维化，保护肾功能，甚至逆转业已形成的肾纤维化。探索增加原核表达的rhBMP-7溶解度的方法，获得可溶性rhBMP-7进而制备注射剂型，可以为研究BMP-7对肾功能衰竭等疾病的作用提供物质基础，对降低成本、拓展rhBMP-7的临床应用范围有重要意义。 研究目的: 1.利用重组大肠杆菌获得高表达量、高纯度的rhBMP-7，然后探索增加rhBMP-7溶解度的方法，获得rhBMP-7，并经去除内毒素、除菌、冷冻干燥等操作，制备rhBMP-7的注射型制剂及冻干粉末，并对制剂的澄清度、稳定性、活性、急性毒性进行检测。 2.建造肾功能衰竭模型，初步探究rhBMP-7注射型制剂对肾衰动物的药理作用。 3.针对包涵体复性工艺方面存在的复性率低的问题，通过先纯化后复性的方法，试图获得更多的rhBMP-7活性二聚体。 研究方法: 1.经重组大肠杆菌的发酵大量表达rhBMP-7，菌体经裂解、洗涤后用8mol/L尿素溶解包涵体，然后采用SP-FF阳离子交换层析法对目的蛋白进行纯化，绝大部分杂蛋白被去除，获得高纯度的目的蛋白，利用逐步降低尿素浓度的方法对纯化的蛋白进行复性从而获得rhBMP-7二聚体，然后通过加入助溶剂L-精氨酸的方法增加rhBMP-7溶解度。采用DEAE-琼脂糖层析的方法去除内毒素，然后经滤膜除菌后制备注射剂型，并采用冷冻干燥的方法制备冻干粉末。采用凝胶电泳法检测制剂的稳定性，采用鲎试剂检测内毒素含量，观察制剂对细胞增值的影响，并观察制剂对啮齿类的急性毒性 2.建立腺嘌呤诱导的大鼠慢性肾衰制模型，将实验动物分为正常组、模型组、模型对照组、rhBMP-7预防组、rhBMP-7治疗组，检测各组大鼠的血液及生化指标，观察rhBMP-7对慢性肾衰大鼠血液及生化指标的影响，并观察其对肾脏病理组织学改变的影响。 3.表达rhBMP-7的工程菌经发酵、裂菌、提取包涵体后，4℃下依次在尿素浓度为4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L的磷酸盐缓冲液中透析使蛋白复性，经凝胶电泳观察rhBMP-7二聚体的生成情况，然后再通过层析色谱法纯化，经凝胶电泳法检测rhBMP-7二聚体纯度。 研究结果: 1.制备的rhBMP-7注射剂溶液澄清度，冻干粉末复溶后无沉淀产生；热原含量在限量以下；能促进细胞的生长，对大鼠和小鼠无急性毒性作用，低温下可较长时间保存。 2.rhBMP-7在不同程度上降低慢性肾衰大鼠的BUN、Cr、UA、磷含量，增加钙含量，改善贫血，降低肾脏指数，减轻肾衰大鼠的肾脏损伤。 3.纯化后复性的方法获得的rhBMP-7以单体和二聚体形式存在，纯度达95％以上，其中rhBMP-7二聚体含量可达60％以上。 结论: 制备的rhBMP-7注射剂溶液澄清，无热原，稳定性较好，有较好的生物学活性，对大鼠和小鼠无急性毒性作用，有一定的应用价值。该制剂对腺嘌呤致大鼠慢性肾衰竭有一定的防治作用。初步建立了先复性然后在低脲浓度下纯化的方法，能够获得含量较高的rhBMP-7二聚体。