猪肺炎支原体可以引起猪支原体肺炎。猪肺炎支原体进入猪呼吸道后可以造成猪呼吸系统障碍、肺脏严重受损以及免疫功能降低等。越来越多的证据表明,猪肺炎支原体进入机体后,免疫系统无法将其彻底清除,即使使用抗菌药物也只能暂时缓解症状。这导致猪肺炎支原体在猪体内的长期存在,造成机体持续感染,对人类防控该病带来了极大的难度,也给全世界养猪业造成重大的损失。自噬是细胞中高度保守的保持稳态的途径,它是一种细胞中内质网膜、高尔基体膜的囊泡包裹细胞内受损的细胞器、折叠错误的蛋白质形成自噬体,自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解其中内容物的过程。同时许多病原菌都可以通过自噬逃避机体免疫系统清除,在细胞中长期存活。本实验室前期研究表明,猪肺炎支原体能进入猪肺组织细胞,诱导自噬发生,但还不清楚猪肺炎支原体具体能进入哪种肺组织细胞。因此,本研究拟明确猪肺炎支原体能进入的肺组织细胞,如果能进入猪肺泡巨噬细胞是否能诱导猪肺泡巨噬细胞的自噬以及通过哪些信号通路诱导自噬发生。（1）Mhp366-N多克隆抗体的制备及应用目的:制备猪肺炎支原体特异性的抗体,为后续猪肺炎支原体的检测做准备。方法:通过重组菌E.coli BL21（DE3）-p ET28a（+）-Mhp366-N表达Mhp366-N蛋白,将表达的Mhp366-N蛋白经镍柱纯化后调整蛋白浓度至2 mg/m L,免疫小鼠制备Mhp366-N多克隆抗体。使用ELISA的方法测定Mhp366-N多抗的效价并检测该多抗是否可用于免疫印迹和免疫荧光试验。结果:成功制备Mhp366-N多克隆抗体,抗体效价最高可达1:512 000,该抗体用于Western blot的最佳稀释比例是1:100 000,用于免疫荧光试验的稀释比例范围为1:1 000～1:1 000 000。结论:制备了Mhp366-N多克隆抗体,该抗体可以用于Western blot和免疫荧光试验。（2）猪肺炎支原体诱导猪肺泡巨噬细胞自噬目的:确定猪肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞后是否可以诱导自噬发生。方法:采集有典型猪支原体肺炎病变及无大体病变的猪肺脏,分离猪肺泡巨噬细胞。套式PCR检测猪肺炎支原体P36基因,免疫组化试验确定猪肺炎支原体进入的肺组织细胞,透射电镜检测细胞内的自噬体数量,Western blot试验确定猪肺炎支原体诱导自噬后相关蛋白表达量变化,免疫荧光试验确定猪肺炎支原体与LC3的共定位和LC3斑点的数量。猪肺炎支原体AH株感染3D4/21细胞后同样检测了胞内自噬体数量、自噬标志蛋白表达、Mhp366与LC3共定位及LC3荧光斑点数量。结果:将分离的猪肺泡巨噬细胞分为猪肺炎支原体阳性和阴性细胞。免疫组化试验证明猪肺炎支原体可以进入猪I型和II型肺泡细胞、肺泡巨噬细胞和支气管上皮细胞。猪肺炎支原体阳性猪肺泡巨噬细胞中自噬体数量,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin 1、Atg5、Atg12-Atg5表达量,表示Mhp366与LC3共定位的黄色荧光斑点数量,LC3荧光斑点数量显著多于猪肺炎支原体阴性猪肺泡巨噬细胞中相应参数。在AH株感染的3D4/21细胞中得到相同结果。结论:猪肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞后诱导了自噬发生。（3）猪肺炎支原体诱导细胞自噬的信号通路研究目的:确定猪肺炎支原体感染细胞诱导自噬的信号通路。方法:猪肺炎支原体AH株感染3D4/21细胞后,Western blot检测LC3-II、Beclin 1的表达量,同时检测JNK、ERK、p38、Akt的磷酸化情况;AH株感染JNK、ERK和Akt抑制剂预处理的3D4/21细胞,Western blot检测LC3-II、Beclin 1表达情况,间接免疫荧光检测细胞内LC3斑点的数量以及LC3与Mhp366的共定位。结果:AH株感染3D4/21细胞后,JNK、ERK以及Akt的磷酸化水平升高,p38的磷酸化水平基本不变;猪肺炎支原体感染JNK、ERK和Akt抑制剂处理的3D4/21细胞,JNK和Akt抑制剂处理组LC3-II、Beclin 1表达量和LC3荧光斑点数量显著下降,而ERK磷酸化抑制剂处理组LC3-II、Beclin 1表达量和LC3荧光斑点数量没有显著变化。结论:猪肺炎支原体可能通过MAPK/JNK和PI3K/Akt信号通路诱导细胞自噬。