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消毒剂从发现至今,已广泛应用于医疗、食品、工业、农业、化妆品等各个行业。季铵盐化合物(quaternary ammonium compounds,QACs)消毒剂由于具有无腐蚀、无刺激性、较稳定且毒性低等优点被广泛用于食品和环境的消毒,是目前最常用的消毒剂之一,其抗菌作用是通过正电荷与细胞膜相互作用实现的,通过与细胞膜相互作用使膜的完整性被破坏、细胞内容物泄漏。每年有小部分QACs在使用后被直接排放到环境当中,而其配方中有效成分的浓度远远超过目标微生物的最低抑制浓度,排放后在环境中经稀释、生物降解后,其浓度梯度下降,导致微生物常暴露于QACs的亚抑菌浓度之中。越来越多的研究表明微生物长期暴露于抗菌药物的亚抑菌浓度下会促进其耐药性的演变,也可能导致对其他抗菌药物如氟喹诺酮类抗生素的交叉耐药和多重耐药。研究目的:通过研究大肠埃希菌外排泵Acr AB-Tol C调控基因marA、mar R、sox S和rob的表达,了解和判断此外排泵在大肠埃希菌对季铵盐化合物产生抗性中的作用以及与氟喹诺酮交叉耐药中的分子机制,为后续研究细菌对消毒剂和抗生素产生交叉耐药的其他机制提供研究思路。材料与方法:1.对选取的6株菌株使用苯扎溴铵进行诱导,并检测菌株诱导前后对苯扎溴铵敏感性的变化。2.检测所有菌株在加入外排泵抑制剂氰化羰基-3-氯苯腙(Carbonyl cyanide3-chlorophenylhydrazone,CCCP)后对苯扎溴铵敏感性的变化。3.PCR扩增检测外排泵调节基因,观察消毒剂外排泵调节基因的携带情况。4.实时荧光定量PCR检测大肠埃希菌诱导株及其亲代株的外排泵调节基因转录情况,并对结果进行统计分析。5.外排泵调节基因扩增片段核酸序列分析:对12株细菌进行mar R、marA、sox S和rob基因进行测序分析。实验结果:1.苯扎溴铵诱导前后的敏感性检测显示:5株诱导株对季铵盐化合物的耐药水平较其亲代株呈4-8倍增高,其中一株在诱导前后敏感性无变化。2.外排泵抑制试验显示:加入外排泵抑制剂后除一株菌敏感性无变化外,其余菌株对苯扎溴铵的MIC下降2-256倍,且诱导株下降倍数高于亲代株。4.外排泵调节基因的检测显示:12株大肠埃希菌marA、sox S、rob基因普遍存在,阳性株12株(100%),mar R基因阳性11株(93.75%)。5.实时荧光定量PCR检测显示:4株诱导株marA基因的转录水平较其亲代增高17～33倍(P<0.05),5株诱导株mar R基因的转录水平较其亲代增高1～10倍(P<0.05)。6.外排泵调节基因mar R、marA、sox S和rob基因测序结果显示:12株受试菌的上述4种调控基因均有多处核苷酸突变,其中突变频率较高并导致氨基酸替换的是:mar R基因142位Tyr缺失(10/12),marA基因145位Ser缺失和Met1Val突变(11/12),sox S基因存在Ser12Ala突变(11/12)。结论:1.marA转录增加致外排泵Acr AB-Tol C的高表达与季铵盐化合物对大肠埃希菌的抗性产生可能有一定关联。2.季铵盐化合物的广泛使用对大肠埃希菌对其抗性的产生及对氟喹诺酮类抗生素耐药性的潜在影响应引起重视。