论文部分内容阅读
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，具有良好的生物相容性和可降解性，一定的机械支撑强度和较高的可塑性，免疫源性较低，广泛的分布在哺乳动物的体内。基于以上这些优点，我们针对不同用途，将胶原蛋白制作成无序和有序的三维支架材料，应用于肿瘤细胞三维培养和神经损伤修复。 二维细胞培养是研究肿瘤细胞生物学的常用方法，但是肿瘤细胞在二维条件下培养并不能有效的展现体内肿瘤特征。目前普遍认为，三维培养系统能在一定程度上模拟体内组织的微环境，所以越来越多的研究者通过三维培养研究肿瘤细胞特性。胶原蛋白是肿瘤细胞外基质的主要成分，直接或间接地参与肿瘤细胞各种生命活动，所以我们利用胶原支架材料建立肿瘤细胞三维培养体系。与二维培养情况相比，在三维胶原材料上培养的MCF-7细胞形态学出现异质性，细胞能够有效的延长体外培养的增值时间，最终形成多层细胞的三维结构。在三维培养条件下，肿瘤细胞上调了促血管发生生长因子的分泌量，这一特性同体内肿瘤的血管发生正相关。将三维培养的乳腺癌细胞消化下来，重新接种到二维细胞培养板上，细胞展现出间质细胞的形态。通过qRT-PCR检测发现，在三维条件下，上皮-间质转化(EpithelialtoMesenchymalTransition，EMT)相关转录因子和间质细胞标记物的表达量是明显上调的，而上皮细胞标记物的表达量是下调的。除此之外，金属外基质蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）的表达水平上调，细胞迁移能力增强，证实在三维条件下培养的肿瘤细胞发生EMT。肿瘤细胞在发生EMT的过程中，普遍上调肿瘤干细胞(CancerStemCells，CSCs)特征，我们进一步检测CSC相关特性基因的表达。在三维培养条件下，细胞自我更新相关基因，包括干细胞标记基因（OCT4A和SOX2）以及CSC特征基因(SOX4、JAG1和CD49F)都明显上调，细胞克隆形成能力明显增强。三维培养的乳腺癌细胞，其表达CD44+/CD24-/low特性的细胞比例明显增加。将培养的细胞直接注射到免疫性缺陷小鼠皮下，同二维培养相比，三维培养细胞的致瘤性明显增强。这些实验结果说明，三维培养的肿瘤细胞能明显上调CSC的特性基因。将体外三维培养的肿瘤结构直接包埋到小鼠皮下，致瘤性明显比二维培养强，进一步表明三维培养能提高肿瘤细胞的恶性程度，为临床上的药物筛选和肿瘤研究提供了一个有效的方法。 在制作三维胶原支架材料的基础上，我们进一步优化制作工艺，制备出三维有序胶原材料，这种有序材料能有效引导神经元细胞沿着特定方向延伸轴突。利用多孔材料和神经营养因子相结合的方法，能够有效治疗脊髓损伤，但由于通过物理结合的神经营养因子易被体液稀释，即使用量过大也达不到有效浓度。本研究中，我们将带有胶原结合区的脑源性神经营养因子(Collagen-BindingDomainBrain-DerivedNeurotrophicFactor，CBD-BDNF)孵育在有序胶原支架材料上，修复大鼠的脊髓损伤。将载有CBD-BDNF的有序胶原材料植入到大鼠脊髓半横断损伤部位，通过BBB评分(Basso，Beattie&Bresnahanlocomotorratingscale，BBBscale)和斜板实验检测大鼠运动功能的恢复。9周后发现，用CBD-BDNF活化的有序材料能有效促进大鼠运动功能的恢复，对照组和材料组则没有恢复。实验结果为脊髓横断损伤治疗提供了一种更为有效的方法。