[目 的]诺如病毒是单股正链RNA病毒,病毒感染主要造成人类急性病毒性胃肠炎,常引起暴发性流行,但由于其基因组易变异、难以在体外进行培养,目前仍未研发出有效的诺如病毒疫苗,本研究首先对临床标本中的诺如病毒进行分离鉴定,通过人B细胞以及恒河猴PBMC感染实验,利用流式分选、Real-Time PCR等技术探索病毒的最佳细胞感染模型,为进一步深入研究诺如病毒动物模型以及研发出有效的疫苗提供实验依据。[方 法]研究的主要内容包括两部分,第一部分首先将从昆明市疾控中心那里拿到的临床样本,提取核酸后,进行PCR反应扩增。由特异性引物PCR后测序得到位于诺如病毒ORF1与ORF2之间694到1020基因位点的部分序列,在线BLAST后通过序列分析比对和构建进化树分析发现它与诺如病毒GⅡ.15型的高度同源。第二部分主要是病毒感染细胞实验,首先将人诺如病毒KM株接种于人B细胞培养,观察传代后细胞发生病变的情况以及不同感染时间病毒的扩增量变化。通过电镜观察以及Western Blot进一步了解诺如病毒颗粒。为了进一步研究人诺如病毒在人B细胞上的增值情况,通过合成标准品构建标准曲线,利用Real-Time PCR对传代培养中基因组扩增情况进行分析,完成病毒的扩增传代,再通过病毒基因组二代测序,获得病毒的全基因序列,通过构建进化树分析进一步确定人诺如病毒KM株的来源;然后进行人诺如病毒KM株感染恒河猴PBMC的分析,首先从新鲜猴子血中分离出PBMC,然后将人诺如病毒KM株接种于PBMC培养,观察传代后细胞发生病变的情况,最后用FACS分选出不同细胞群,利用Real-Time PCR分析人诺如病毒在不同细胞群中的扩增情况进行分析。[结 果]通过第一部分的实验内容,鉴定并命名了人诺如病毒KM株,通过PCR得到一段位于诺如病毒ORF1与ORF2之间的短基因片段,通过序列分析比对和构建进化树分析发现它与诺如病毒GⅡ.15型的高度同源;第二部分实验,通过构建人诺如病毒的标准曲线,利用Real-Time PCR对病毒进行定量检测,发现人诺如病毒KM株可以感染人B细胞并在细胞中进行传代增值,且感染后48h病毒的扩增量最大以及病毒传至第五代时可获得最大的拷贝值,完成病毒的培养扩增以便接下来的实验进行,并获得该病毒株的全基因序列,通过全基因序列以及构建进化树分析,认为人诺如病毒KM株与Norovirus GⅡ/Hu/JP/2007/GⅡ.P15_GⅡ.15/Sapporo/HK299 高度同源;同时通过流式分选可以看出恒河猴全血中分离出PBMC中不同CD群的细胞对诺如病毒的敏感性不同,其中CD11c+细胞对诺如病毒敏感性最高。[结 论]人诺如病毒KM株与GⅡ.15型诺如病毒高度同源,人诺如病毒KM株可以感染人B细胞并在细胞中进行传代增值,并且对恒河猴全血分离出PBMC中的CD11c+细胞高度易感,进一步推动对诺如病毒感染的动物模型的研究进展。