梅毒患者外周血单个核细胞microRNA表达谱检测及其靶基因功能预测分析

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背景:  梅毒是由梅毒螺旋体感染引起的慢性、性传播疾病。梅毒螺旋体能够侵袭人体全身多个器官和系统,给患者带来巨大伤害。二期梅毒为梅毒螺旋体感染的急性期,会出现皮疹、脱发、粘膜斑、全身淋巴结肿大,甚至出现内脏、眼和神经系统损害等;梅毒螺旋体感染会侵犯骨骼、心血管、中枢神经等系统,引起被侵犯器官的不可逆性损害。侵犯神经中枢系统引起的神经梅毒带来的危害巨大,而目前对于其诊断仍然存在挑战,值得关注。很多研究表明miRNAs在多种疾病的发生发展中有重要调控作用,并在疾病的诊断以及预后中有重要的应用价值。目前,没有关于梅毒患者外周血单个核细胞miRNA表达谱及其临床应用的报道。本研究采用miRNA芯片检测二期梅毒和神经梅毒患者外周血单个核细胞的miRNAs表达谱,筛选出若干差异表达显著的miRNAs,并通过real-time qPCR技术验证结果的准确性,为深入研究miRNAs在梅毒的发病机制中的作用以及进一步研发miRNAs作为神经梅毒的诊断标记物奠定基础。  目的:  探讨miRNAs在梅毒感染中的调控作用及在其分子分型中的潜在应用价值。  方法:  1.采用miRNA表达谱芯片技术检测8例二期梅毒患者、6例神经梅毒患者和5例健康体检者的外周血单个核细胞的miRNAs的差异表达,结合生物信息学技术筛选出显著差异表达的miRNAs;  2.采用美国ABI公司设计合成的miRNA逆转录引物和表达分析探针,通过Real-time qPCR方法在30例正常人、31例二期梅毒和33例神经梅毒患者中验证芯片筛选的差异表达的miRNAs,鉴定芯片的可靠性;  3.通过targetscan、miRDB、RNA22三个数据库预测差异表达miRNAs的靶基因,并选择三个数据库共同支持的靶基因进行GO分析和KEGG pathway分析,为深入研究其生物学功能奠定理论基础。  结果:  1.通过microRNA基因芯片检测三组样本中miRNAs表达谱,以及生物信息差异基因分析和聚类分析共筛选出39条在神经梅毒中显著差异表达的miRNAs(P<0.05),其中18条miRNAs上调,21条miRNAs下调,二期梅毒中此39条miRNAs表达水平介于两者之间,提示可能存在特异性的miRNA可以作为诊断神经梅毒的分子标记物;  2.实时荧光定量PCR验证13条差异表达的miRNAs,13条差异表达的miRNAs表达趋势在各组之间与芯片结果一致,因此芯片结果的验证率为100%,芯片结果具有较高的可靠性;  3.利用targetscan、miRDB和RNA22三个miRNA靶基因数据库预测靶基因,取靶基因交集后发现39条miRNAs共有靶基因5489个;  4.对预测的靶基因进行GO分析后发现miRNA调控的靶基因在生物进程上主要参与转录调控、RNA代谢过程调控、细胞内信号转导、蛋白结合、细胞凋亡、程序性死亡等过程;而在细胞组成上,靶基因主要定位于细胞膜、细胞质以及细胞内的细胞器等部位;其参与的分子功能主要集中于金属离子的结合、核苷酸分子的结合、转录调节因子的激活等方面;  5.针对预测的靶基因进行KEGG pathway分析后,发现miRNA调控的靶基因主要参与细胞凋亡、B细胞信号通路、内吞作用、焦点粘连、白细胞经内皮迁移通路、趋化因子信号通路、T细胞信号等通路;  6.预测miR-21-3p靶基因参与机体重要的免疫调节信号通路,下调机体免疫,推测其在梅毒感染过程中协助梅毒螺旋体的长期潜伏,形成慢性感染。  结论:  本研究通过miRNA芯片技术在二期梅毒和神经梅毒患者PBMC中筛选出39条差异表达的miRNAs,并且通过荧光定量PCR探针法扩大检测临床样本后验证芯片结果具有较高的可靠性;39条差异表达的miRNAs在三组之间差异明显,可以有效区分神经梅毒,提示miRNAs可能可以用于梅毒的分子分型,为进一步寻找外周血的miRNAs作为神经梅毒的诊断和预后的标记物奠定了重要基础;生物信息学预测了了差异表达的miRNAs靶基因,并分析其潜在的生物学功能及相关的分子机制。初步预测miR-21-3p在梅毒螺旋体感染时下调机体免疫,可能协助梅毒螺旋体长期潜伏于机体内形成慢性感染。这些预测结果为深入研究miRNA在梅毒的发病机制过程中的调控作用奠定了理论基础。
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