miR-133b对轴突生长的调控作用及其机制研究

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:woai6672690
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脑、脊髓等CNS(central nerve system,中枢神经系统)损伤后可遗留严重的神经功能障碍,威胁人类健康,影响人们生活质量,并且目前尚无有效的治疗方法。研究表明,脑、脊髓损伤后神经传导束无法再生是导致神经功能难以恢复的重要因素之一。CNS损伤后局部环境中存在神经元轴突生长抑制物,包括Nogo-A、MAG(myelin-associated glycoprotein,髓磷脂相关糖蛋白)和星形细胞分泌的CSPG(Chondroitin sulphate proteoglycans,硫酸软骨素蛋白多糖)。这些抑制分子与轴突顶端的生长锥接触后,可与神经元细胞膜上的Nogo受体等结合后激活Rho随后活化Rho相关激酶(Rho-associated kinase,ROCK),导致神经元细胞骨架结构发生变化,继而引起生长锥塌陷、回缩,神经轴突停止生长。MicroRNA是一类内源性非编码RNA,能够识别其靶基因3’UTR区的互补位点并与之结合,通过转录后途径调控靶基因蛋白的表达,其在CNS发育过程中具有重要作用。最近,越来越多的研究发现miRNA在神经细胞轴突生长、分叉、导向和再生中也扮演重要角色,比如miR-34a可调控小鼠轴突生长和脊髓形态、功能,miR-124a与轴突分叉密切相关,而lin-4 mi RNA等则与神经轴突导向、靶细胞定位等相关。研究报道miR-133b在多种肿瘤组织中差异表达,包括前列腺癌、肺癌和消化道肿瘤。在中枢神经系统中,miR-133b在人类及小鼠的中脑组织中表达增高,并且能够通过调控靶基因Pitx3的表达在中脑多巴胺神经元的分化中起重要作用。另外Yu等人发现miR-133b与脊髓损伤后神经功能恢复有关,而且与卒中后功能恢复也密切相关,但是miR-133b在神经细胞中对于轴突生长的作用及相关机制尚未有研究,另外miR-133b是否与CNS损伤后轴突生长抑制分子对神经传导束再生的抑制作用相关亦无报道。目的:探讨miR-133b对神经细胞轴突生长的调控作用及其分子机制。方法:第一部分:制备miR-133b过表达和miR-133b inhibitor以及相应对照慢病毒,并通过gfp(greenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白)表达量筛选最佳转染效率。首先分别转染mir-133b过表达和对照慢病毒,qrt-pcr方法检测两组细胞中mir-133b表达量,并进一步分析两组细胞轴突生长情况;其次通过mir-133binhibitor干扰细胞内mir-133b表达并观察其对轴突生长的影响;另外,利用tunel和mtt方法检测mir-133b对pc12细胞凋亡和增殖的影响;最后利用ngf(nervegrowthfactor,神经生长因子)进一步探究mir-133b是否与神经分化相关。第二部分:制备rhoa特异性sh-rna和rhoa过表达质粒及相应对照质粒。利用westernblot和qrt-pcr的方法检测过表达或抑制mir-133b对rhoa蛋白及mrna表达的影响及相互关系。通过sh-rna抑制细胞内rhoa蛋白表达,进一步研究rhoa蛋白对pc12细胞轴突生长的影响,最后通过补救实验验证mir-133b对促进pc12细胞轴突生长的作用机制是否呈rhoa依赖性。第三部分:利用westernblot方法检测mir-133b过表达是否能促进某些轴突生长相关通路的激活(如mapk和pi3k/akt等);接着干扰细胞内mir-133b观察这些通路可否被抑制,另外利用通路特异性抑制剂抑制关键分子磷酸化验证mir-133b对轴突生长的调控是否是通路依赖性;最后利用sh-rna等技术观察mir-133b靶基因的表达是否与这些通路的激活相关。第四部分:体外提取、培养、纯化大鼠原代神经元细胞,通过慢病毒调控神经元内mir-133b表达,观察其是否神经元神经轴突生长相关。另外利用cspg体外模拟cns损伤后对轴突生长的抑制作用,观察mir-133b能否减弱轴突生长抑制因子对神经轴突生长的抑制作用。结果:第一部分:在pc12细胞中,mir-133b调控其轴突的生长,过表达mir-133b促进轴突生长,相反,下调pc12细胞中mir-133b表达抑制轴突生长,但是mir-133b不影响pc12细胞的神经分化。第二部分:过表达mir-133b抑制pc12细胞中rhoa蛋白的表达,但是对mRNA没有影响。利用质粒介导的shRNA干扰PC12细胞内RhoA表达能够模拟miR-133b对轴突生长的促进作用,而共转染RhoA质粒和可消除miR-133b对PC12细胞轴突生长的促进作用。第三部分:miR-133b的过表达促进了ERK1/2和Akt丝氨酸473位点的磷酸化,但是对p38的磷酸化没有影响,而且加入PI3K抑制剂LY294002和MAPK激酶MEK1抑制剂PD098059可以分别消除miR-133b对轴突生长的促进作用。和过表达miR-133b类似,抑制RhoA蛋白的表达也促进了ERK1/2和Akt(Ser473)的磷酸化。第四部分:在大鼠原代皮层神经元中,过表达mi R-133b能够通过抑制RhoA蛋白的表达促进神经轴突的生长;神经轴突的生长在CSPG包被的培养皿中受到抑制,而miR-133b可以逆转其抑制作用促进轴突生长。结论:综上所述,本实验发现miR-133b可以促进神经轴突的生长,可能的机制是miR-133b抑制了神经细胞中RhoA蛋白的表达和RhoA/ROCK信号通路,并减弱了CSPG对神经轴突生长的抑制作用,同时激活了MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路,从而促进了神经轴突的生长。
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