海膜(Halymenia sinesis)隶属于海膜科(Halymeniaceae)红藻。蜈蚣藻属海藻与海膜均隶属于海膜科,但在近几年的研究结果表明,蜈蚣藻多糖具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗凝血和调节免疫等作用,具有开发成药物的潜在价值。虽然关于蜈蚣藻属海藻多糖的研究成果较多,但目前,未有对海膜多糖的提取工艺及分离纯化的学术论文,后期的结构分析及药理活性也未进行详细的研究。本论文以采自浙江舟山枸杞岛的海膜藻为原料,对海膜多糖的提取工艺、分离纯化和结构分析进行研究。本文包括三个部分,即超声波辅助提取海膜多糖的工艺参数优化、海膜粗多糖的分离纯化、海膜均一多糖的结构分析。研究工作及主要成果如下:第一部分:超声波辅助提取海膜多糖的提取工艺优化。1、水浴提取工艺单因素试验:采用热水提取海膜多糖,通过单因素试验研究水浴提取时间和提取温度对海膜多糖提取率的影响,确定了最佳水浴提取工艺参数为提取时间4 h,提取温度90℃,此时多糖提取率最大。2、超声波辅助提取工艺试验:采用超声波辅助提取海膜多糖,进一步优化海膜多糖提取工艺。通过单因素试验和L9(33)正交试验研究超声功率、超声时间和料液质量浓度对多糖提取率的影响。确定了最佳超声波辅助提取工艺参数为料液质量浓度0.020 g/m L、超声时间60min、超声功率400W,此时提取率最大,多糖提取率为36.91%,总糖含量为63.85%。通过对正交试验结果分析得料液质量浓度是影响多糖提取率的主要因素,对多糖提取具有显著影响,其次是超声时间,再次是超声功率。第二部分:海膜粗多糖的分离纯化。1、利用阴离子交换色谱柱Q-FF(Q-Sepharose Fast Flow)法对超声波辅助提取获得的海膜多糖HSPS进行初步分离纯化,确定多糖主要洗脱成分为蒸馏水、1.0mol/LNa Cl、1.5mol/LNa Cl、0.2mol/LNa OH,其分子质量分别为1.35×105Da、4.81×104Da、5.33×104Da、9.47×104Da。2、利用Superdex-200葡聚糖凝胶过滤层析法对Q-FF获得的4种多糖进行二次纯化,获得6种分子量相近,极性相同的均一多糖组分:HSPS1-Ⅰ、HSPS2-Ⅱ、HSPS3-Ⅰ、HSPS3-Ⅱ、HSPS4-Ⅰ、HSPS4-Ⅱ。经HPLC检测为单一对称峰,说明6种海膜多糖组分为均一多糖,分子量相近,极性相同,其相对分子量分别为4.31×105 Da、5.62×104 Da、1.29×105 Da、8.20×104 Da、3.70×105 Da、1.77×105 Da。第三部分:海膜均一多糖的结构鉴定1、采用酸水解法结合气相色谱-质谱法(GC-MS)测定海膜多糖单糖组成。选取每种洗脱浓度成分中的一种,即HSPS1-Ⅰ、HSPS2-Ⅱ、HSPS3-Ⅰ和HSPS4-Ⅰ,酸水解后分别用GC-MS检测,结果表明4种多糖的单糖组成较为简单,均为2种,分别为半乳糖和葡萄糖,半乳糖摩尔含量在95%左右。从而证明了海膜多糖主链是由半乳聚糖组成。2、采用红外光谱(IR)鉴定海膜多糖构型。结果表明5种多糖在3600-3200cm-1处出现一宽峰,说明存在多糖分子中分子间或分子内O-H的伸缩振动;在2930 cm-1附近出现吸收峰,说明是烷基中C-H的伸缩振动,由海膜多糖存在这2种特征吸收峰可以证明该类化合物为糖类化合物。5种多糖在1730 cm-1左右有吸收峰说明有糖醛酸存在;1730-1600 cm-1处有吸收峰,证明多糖存在-COO-的C=O键伸缩振动或多糖中含有少量结晶水;在1416 cm-1处有-COOH中C-O的吸收峰;1246 cm-1处有强吸收峰,为磺酸基中S=O的伸缩振动。5种多糖在1100-1010 cm-1处均有3个强吸收峰,说明均含有吡喃糖苷键,含有C-O-C特征骨架;在844±8 cm-1处有吸收峰说明多糖均含有α-糖苷键。3、一维、二维核磁共振(1D、2D NMR)分析其糖残基类型、连接顺序及取代位点。通过1H NMR分析发现,5种多糖异头碳上氢的化学位移δ为4.30-4.60ppm和5.05-5.60ppm范围内,表明多糖含有α-型和β-型2类糖苷键,并在1.35-1.45ppm为有丙酮酸。通过13C NMR分析发现,5种多糖异头碳的化学位移在δ95-100ppm和δ100-105ppm范围内,表明多糖含有α-型和β-型2类糖苷键;由于多糖的信号大多数集中在δ60-85ppm的范围内,可以判断该多糖为吡喃环。5种多糖在δ75-85ppm,有明显的信号,因此可以判断多糖在C2,C3,C4发生取代;在低场δ176.5-177.7ppm处有丙酮酸C1的信号,在δ101.98ppm有C2的信号,初步判断多糖含有p G糖苷键。通过DEPT NMR发现在δ61-63ppm,δ65.6-66.8ppm,δ68-69.5ppm处有信号,可以判定C6发生取代。通过H-H COSY及HSQC NMR分析发现,HSPS1-Ⅰ含有GP→LA2M、GP→L、G2S→LA2M、G2S→D和G2S→LA连接;HSPS2-Ⅱ含有GP→LA2M、G→D、GP→L、G→LA2M、GP→L6S、G2S→D和G6M→D连接;HSPS3-Ⅰ含有G2,4,6S→LA2S、G2,4,6S→LA2M、GP→LA2S和GP→LA2M;HSPS3-Ⅱ含有G2,4,6S→L2S、G2,4,6S→LA2M、GP→L2S、GP→LA2M、G→D、G4S→L2S、G2S→D和G2S→L2S连接;HSPS4-Ⅱ含有GP→L2S、G2S→DA、G2S→L2S、G→D和G6M→L连接。