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近年来,随着全球气候逐渐上升、城市化进程的加快、旅游和贸易的快速发展、生态环境的不断变化,急性传染病发病呈上升趋势,如1997年香港H5N1疫情,2003年SARS疫情,2008年安徽阜阳HFMD疫情以及2009年爆发的甲型H1N1流感,传染病的流行频度不断增加。因此,相应的检测和监测技术要及时跟进,以适应新的疾病监测需求。本论文采用荧光定量PCR技术和等温扩增技术(LAMP)检测H1N1-pdm09和EV71病毒,并结合其它实验手段综合研究病毒,开展了以下几个方面的工作。1、2009甲型H1N1流感病毒核酸快速检测方法的建立及HA基因的分子特性研究2009甲型H1N1流感(H1N1-pdm09)最初发现于2009年3月在墨西哥暴发的“人感染猪流感”疫情,并迅速在全球范围内蔓延。自2009年5月11日国内报告首例甲型H1N1流感确诊病例以来,我国内地累计报告甲型流感确诊病例12.8万余例,死亡病例805例。本课题研究建立了基于荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测H1N1-pdm09的方法,并对H1N1-pdm09 HA基因的分子生物学特性进行了初步研究。在本论文的研究中,我们重新设计了一套不同于WHO推荐的引物和探针,新的引物和探针位于H1N1-pdm09 HA片段的保守区。研究表明,新的检测体系比WHO推荐体系敏感性高10倍,可以达到25拷贝RNA。同时,我们检测了临床收集的83份流感样样本,新的检测体系可检出32份阳性样本,而WHO推荐体系只能检出25份阳性样本,研究结果进一步证明,在H1N1-pdm09的检测中,我们新的检测体系灵敏度比WHO推荐体系要好。同时,我们开发了环介导等温扩增技术(RT-LAMP)用于临床样本的检测,实验结果表明,RT-LAMP技术特异性和敏感性与荧光定量RT-PCR相当,同时,我们比较并成功地开发了可视化LAMP检测,通过肉眼观察即可判定检测结果,可视化LAMP检测技术可很好的应用于临床检测或基层现场检测防控。对江苏泰州市分离得到的H1N1-pdm09 (A/Taizhou/09/2009)进行HA基因序列测定,并进行分子生物学特征分析。首先应用RT-PCR扩增出HA基因片段,然后克隆并送测序,对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,分析表明泰州地区2009-2010年流行的流感病毒优势株与国内外其它地区流感毒株有高度同源性。2、EV71病毒核酸荧光定量RT-PCR检测方法的建立及VP1基因的分子特性研究手足口病(Hand-foot-mouth Disease, HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病,多发生于5岁以下儿童,是我国法定报告管理的丙类传染病。柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)是HFMD最为常见的病原体。近年来,EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势,2008年,安徽阜阳发生手足口病爆发流行,全国累计报告489,073例病例,严重病例1165例,占报告病例数的0.24%,死亡126例。本课题研究建立了基于荧光定量RT-PCR检测EV71的方法,并对EV71 VP1基因的分子生物学特性进行了初步研究。在本论文的研究中,我们设计并筛选了一套引物和探针,引物和探针位于EV71 VP1片段的保守区。研究表明,我们的检测体系比中国卫生部推荐常规PCR检测体系敏感性高。同时,我们检测了临床收集的110份临床手足口病疑似病例样本,我们设计的荧光定量RT-PCR检测体系可检出48份阳性样本,而中国卫生部推荐常规PCR体系只能检出31份阳性样本,研究结果进一步证明,在EV71的检测中,我们新的检测体系灵敏度比中国卫生部推荐体系要好。对江西省南昌市和湖北省鄂州市分离得到的9株EV71进行VP1基因序列测定,并进行分子生物学特征分析。首先应用RT-PCR扩增出VP1基因片段,然后克隆并送测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析。分析表明江西南昌和湖北鄂州地区目前流行的EV71病毒优势株为C4亚型,也存在少数A亚型EV71毒株,与国内其他学者的报导基本一致。3、病毒性肝炎样本库及HBV耐药检测平台的建立肝病在我国是常见病和多发病,中国是乙肝的高发区,世界卫生组织发布的数据显示,中国有1.4亿乙型和丙型肝炎病毒带原者,约占全球乙、丙两型肝炎病毒携带者的28%；其中有3200万慢性活动性肝病患者,每年有40万人死于病毒性肝病；另外我国现有29.7万肝癌患者,占全球肝癌患者总和的一半以上(55%)。《慢性乙肝防治指南》明确指出慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化和对症治疗,其中抗病毒治疗是关键,只要有适应症且条件允许,就应进行规范的抗病毒治疗。当HBV对某些药物产生耐药性时,病毒基因会发生一些明确的突变,而这种基因型耐药往往在表型耐药前1-3个月出现,因此在临床上对病毒进行耐药基因型的检测,将有助于帮助医生及时给出或调整治疗方案,延缓或阻止表型耐药的发生。目前认为,HBV对核苷类似物耐药性的产生与HBV P基因(聚合酶区)变异有关,并且HBV P基因变异是多位点的。因此我们联合泰州市人民医院肝科开展HBV肝炎患者耐药突变检测,科学指导临床用药；同时本课题也成功建立了一步法扩增HBV全长基因组序列,可用于HBV遗传进化分析；我们也成功建立了泰州地区的病毒性肝炎样本库,目前样本库已收集近100份临床资料可溯源的样本,并且样本库将继续扩增,为后续研究打下基础。