论文部分内容阅读
目的:癌症是世界发病率最高的疾病之一,癌细胞会破坏骨组织的结构,造成中枢神经系统的敏化以及产生剧烈的疼痛。本研究以炎症信号的激活为切入点,探究AMPK在癌症引起的骨痛（CIBP）中的作用及机制,进一步分析AMPK激活剂在CIBP中的镇痛作用,为癌痛的治疗提供研究策略和潜在靶点。方法:雄性SD大鼠胫骨骨髓腔注入MRMT-1乳腺癌细胞建立CIBP模型,采用行为学（机械性痛觉）检测、影像学（X射线）和形态学（HE染色）分析评估模型建立成功与否。待确定CIBP模型建立成功后,进行AMPK激活剂AICAR鞘内注射,给药0 h、3h、6 h后检测50%缩足阈值。行为学检测后处死动物,收集脊髓组织分别进行固定切片和蛋白质提取,并进一步分析组织形态及蛋白质表达变化。HE染色分析脊髓炎症浸润情况;免疫荧光确定脊髓胶质细胞激活状态;蛋白质组学分析脊髓AMPK水平并进行验证;行为学检测确定AICAR镇痛效果;透射电镜观察大鼠脊髓线粒体损伤情况;免疫荧光和免疫印迹分析线粒体相关蛋白、NLRP3炎症信号各组分以及自噬相关蛋白的表达水平。细胞水平分析AICAR对炎症诱导的线粒体损伤的保护作用。用蛋白质印迹检测各组相关蛋白水平,采用线粒体膜电位试剂盒分析细胞水平线粒体膜电位的变化,活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧的水平。结果:（1）成功建立CIBP大鼠模型:CIBP大鼠机械痛觉阈值降低、X射线显示骨组织损伤、HE染色显示骨小梁缺失;（2）CIBP大鼠脊髓炎症增加并伴随胶质细胞激活;（3）CIBP大鼠AMPK/Drp1通路活性改变对线粒体的影响:CIBP大鼠脊髓AMPK活性降低、Drp1线粒体分裂活性增加、线粒体损伤比例增加;（4）CIBP大鼠NLRP3炎症小体介导的炎症信号增加:NLRP3、Activated-caspase-1和IL-1β表达均增加;（5）CIBP大鼠自噬信号增加:Parkin、ASC、PINK1、LC3B、p62、TOM20和Cytochromoe c表达增加;（6）AICAR通过抑制脊髓炎症和自噬信号缓解骨癌痛:鞘内注射AMPK特异性激活剂AICAR增加CIBP大鼠机械痛觉阈值、抑制胶质细胞激活、降低Drp1分裂活性、下调脊髓炎症和自噬信号;（7）细胞水平验证AICAR可抑制炎症诱导的线粒体功能损伤:AICAR上调TNF-α引起线粒体膜电位降低、下调TNF-α诱导的线粒体ROS水平增加。结论:AMPK特异性激动剂AICAR可通过减少Drp1介导的线粒体损伤和功能紊乱,进而下调炎症及自噬信号,从而缓解CIBP大鼠痛觉行为,发挥镇痛作用。