分子印迹聚合物的制备及其在生物体液中酪氨酸和甘氨酸的代谢产物分析中的应用研究

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氨基酸在生命体中是不可或缺的一类物质,一些非必需氨基酸及其代谢物与人类某些疾病有一定的关联性。酪氨酸与甘氨酸是人体中重要的非必需氨基酸,这两种非必需氨基酸的代谢异常与某些疾病有一定的联系。研究发现肝肾疾病、恶性肿瘤等疾病发生时,酪氨酸、甘氨酸的代谢会出现异常。因此,研究建立简便、灵敏、快速的分析方法并运用到人体体液中酪氨酸、甘氨酸的代谢物分离与分析检测,对某些疾病的辅助诊断、治疗与监测有着重要的现实意义。本文研究制备了相关的分子印迹聚合物,并用于人体体液中酪氨酸、甘氨酸的代谢物的分离富集,结合超高效液相色谱分析技术,构建了人体体液中酪氨酸、甘氨酸的代谢物分析新方法,并用于实际尿样检测,取得了满意的效果。其主要研究成果如下:1.以对羟苯基乙酸为模板分子,1-乙烯基咪唑为功能单体,三甲基丙烷三丙烯酸酯为交联剂,N-N偶氮二异丁腈为引发剂,乙腈为溶剂,采用沉淀聚合的方法,制备了对羟苯基乙酸分子印迹聚合物(PHPAA-MIP)。根据吸附动力学实验探究了PHPAA-MIP吸附机理,评估了PHPAA-MIP的识别性能及其选择性能。结果表明,PHPAA-MIP对尿样中的对羟苯基乳酸、对羟苯基乙酸以及对羟苯基丙酸有较高的选择吸附性能。2.建立了基于分子印迹聚合物分离富集-超高效液相色谱法测定人体尿液中的对羟苯基乳酸、对羟苯基乙酸和对羟苯基丙酸的分析新方法。尿样稀释一倍,经ENVI-C18柱除无机盐,用PHPAA-MIP萃取目标分析物,最终的解吸液用UHPLC-FLD检测。在优化的萃取/解吸条件下,采用ZORBAX SB-C18快速分离柱,以50 mmol/L乙酸-乙酸铵(pH=5.3):乙腈=95:5(V/V)为流动相,流速为0.2 mL/min下分离,荧光检测波长为λex=277 nm、λem=316 nm。三种分析物的检测限和定量限分别为8.5×10-3-2.8×10-2 mg/L与2.8×10-2-9.3×10-2 mg/L,加标回收率为75.7%-110.3%,相对标准偏差小于15%。该方选择性好,可用于尿液中三种酪氨酸的代谢产物的同时测定。3.以N-苯基甘氨酸为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,三甲基丙烷三丙烯酸酯为交联剂,N-N偶氮二异丁腈为引发剂,乙腈为溶剂,采用沉淀聚合法制备了分子印迹聚合物(NPG-MIP)。采用各种分析技术对所制备的聚合物进行了表征,并研究了该分子印迹聚合物的吸附特性。结果表明,NPG-MIP对目标分析物的吸附比NIP具有更好的亲和性,对目标分析物的结构类似物选择性差,印迹因子IF=4.7。该材料为从复杂样品中(尿样)分离NPG奠定了基础。4.建立了基于分子印迹聚合物分离富集-超高效液相色谱法测定人体尿样中N-苯基甘氨酸的分析新方法。尿样稀释20倍后,采用NPG-MIP印迹聚合物对尿样进行前处理,UHPLC-DAD检测其解吸液。在优化萃取/解吸条件下,采用ZORBAX SB-C18快速分离柱,以20 mmol/L磷酸二氢钠(pH=5.6):甲醇=90:10(V/V)为流动相,流速为0.2 mL/min下分离,紫外检测波长为λ=239 nm。NPG的线性范围在0.5-100 mg/L,检测限与定量限分别为1.6×10-2 mg/L和5.5×10-2mg/L,该方法的加标回收率高于84.7%,相对标准偏差小于11%。该方法对目标分析物具有较高的选择性,为进一步探究甘氨酸的代谢与癌症之间的关联性提供了方法学基础。
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