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第一部分CD20表达比例和强度在慢性淋巴细胞白血病中的预后价值目的：慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL)患者CD20表达水平存在异质性，本项研究旨在探讨CD20表达水平在CLL患者的预后价值。方法：2003年1月至2011年12月在我院住院的172例初诊CLL患者。患者外周血标本均进行流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测，分析CD19+细胞的CD20、CD38和ZAP-70表达水平。间期荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization，FISH)检测细胞遗传学异常。聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction， PCR)结合DNA测序检测p53基因和免疫球蛋白重链可变区(Immunoglobulin variable heavy chain，IGHV)基因突变。结果：172例CLL患者，CD20在CD19+细胞中位表达比例为97.82%(0~100%)，中位平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)为731.45(0~9071.90)。IGHV突变组CD20平均表达比例高于IGHV无突变组，分别为92.10%和80.40%(P<0.001)，CD20MFI在各预后指标组间均无明显差异(如IGHV突变状态等)。采用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)确定CD20表达比例在预测CLL患者IGHV突变的最佳临界值，曲线下面积(Area under thecurve，AUC)为0.661(95%CI：0.569~0.753)。CD20表达比例在IGHV突变预测的最佳临界值为60.30%，敏感性和特异性分别为90.00%和38.46%。CD20表达比例高于60.30%组无治疗生成时间(Treatment-free survival，TFS)比CD20表达比例低于60.30%组长(HR=0.452，95%CI：0.232~0.884，P=0.020)，多变量Cox回归分析显示CD20表达比例和MFI均与TFS无相关性(P<0.05)。结论：CD20表达水平为CLL的预后指标之一，且高表达水平患者预后优于低表达患者，但不是独立性的预后因素。第二部分CD20单核苷酸多态性与慢性淋巴细胞白血病细胞CD20低表达相关性研究目的：利妥昔单抗(Rituximab，RTX)现已在临床中广泛应用，部分CLL患者存在对其原发或继发耐药，但具体机制仍未明确。本项研究以CD20低表达为研究重点，探讨CD20蛋白编码区是否存在突变进而影响CD20表达量。方法：针对CD20基因编码区Exon3~8分别设计6对引物，通过PCR扩增技术检测92例初诊CLL患者及200例正常对照样本CD20基因，后行基因序列检测。同时提取CLL患者外周血标本总RNA行CD20mRNA相对定量分析。FCM检测CLL细胞CD20表达比例和MFI。结果：3.26%(3/92)初诊CLL患者存在Exon-3c.246C>T (rs17155019)；8.69%(8/92)初诊CLL患者存在Exon-4c.632C>T (rs2070770)，其余外显子均未发现任何异常。CLL人群rs17155019和rs2070770两个单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)位点C/C基因型频率明显高于正常对照人群，分别为96.74%和93%；91.31%和81.00%，且具有统计学差异(P<0.01)；提示两SNP的C/C基因型可能为CLL的易感基因型。两个SNP位点的不同基因型间CD20mRNA水平、CD20表达比例和MFI均无明显统计学差异(P<0.05)。结论：CLL患者CD20低表达与CD20基因编码区SNP无相关性。第三部分microRNA与慢性淋巴细胞白血病细胞CD20低表达相关性研究目的： microRNA(miRNA)在生物体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动中发挥重要作用。它主要通过与靶标基因3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。本实验目的为研究miRNA与CD20表达调控之间的关系。方法：分别检索三个数据库预测可能调节CD20的miRNA，包括hsa-miR-1、hsa-miR-221、hsa-miR-499-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-632和hsa-miR-708等。体外化学合成6个miRNA mimics，应用lipofectamine2000体外转染13例初诊CLL患者原代细胞，培养24h，通过RT-PCR检测CD20mRNA表达水平；FCM检测CD20表达比例和CD20MFI的变化。结果：通过RT-PCR方法分别检测hsa-miR-1、hsa-miR-221、hsa-miR-499-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-632和hsa-miR-708表达水平，提示转染效率可。对6组转染miRNAmimic和阴性对照(Negative control，NC)组分别检测CD20mRNA和蛋白水平，与对照组比较提示无明显统计学差异(P<0.05)。结论：提示hsa-miR-1、hsa-miR-221、 hsa-miR-499-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-632和hsa-miR-708的靶基因不包括CD20，CLL细胞CD20的低表达量可能与其不相关。第四部分CD20基因启动子甲基化水平与慢性淋巴细胞白血病细胞CD20低表达相关性研究目的：表观遗传学在肿瘤的病理过程中发挥重要的作用。CLL细胞CD20低表达可能与表观遗传学的调控相关。本研究拟探讨组蛋白乙酰化与启动子甲基化与CD20表达之间的关系。方法：分别以1mM、2mM和4mM的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histonedeacetylase inhibitors，HDACI)丙戊酸(Valproic acid，VPA)处理CLL原代细胞，培养24h和48h后通过RT-PCR和FCM检测CD20mRNA和蛋白水平变化；DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)(100μM)处理CLL原代细胞，分别培养24h、48h和96h后收集细胞，通过RT-PCR和FCM检测CD20mRNA和蛋白水平变化。生物信息学软件分析CD20启动子区；亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite genomic sequencing，BSP)对CLL细胞CD20启动子区行甲基化分析，包括：用重亚硫酸盐处理基因组DNA；分别设计3对引物，对CD20启动子区6个CpG行PCR扩增；PCR产物割胶纯化后TA克隆，挑取10个克隆测序。结果： VPA1mM培养24h CD20mRNA水平增加明显，但CD20蛋白水平未见明显增加；5-Aza-dC处理24h后可明显提高CD20mRNA水平、处理48h后可明显提高蛋白水平。BSP结果显示6个CpG均存在部分甲基化，分别为28%(14/50)、24%(12/50)、8%(4/50)、20%(10/50)、6%(3/50)和16%(8/50)。CD20表达量明显增高的患者其CD20启动子总的甲基化比例仅为11.67%(7/60)。CD20表达比例和强度与CD20启动子甲基化比例无明显相关性。结论：表观遗传学机制可能与CLL的CD20低表达相关；去甲基化药物可提高CLL细胞CD20表达。