目的:肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,其在所有肿瘤中的死亡率最高,并且肺癌的发病率依然在逐年上升。肺癌患者中大约85%被诊断为非小细胞肺癌,虽然针对非小细胞肺癌的各项治疗在不断更近,但目前最有效的治疗方法仍然是外科手术治疗,并且其5年生存率仍然很低,因为即便患者得到最早的的诊断,进行最及时的手术治疗,也都可能会最终毙命于局部或者全身继发的系统性肺癌转移,因此肺癌细胞的迁移能力以及增殖能力直接影响肺癌的死亡率,发现并确定改变肺癌细胞迁移和增殖功能的癌症相关基因并揭示其影响肺癌的机制对肺癌的治疗有重要的意义。越来越多研究表明,肿瘤抑制因子p53基因的突变或失活与多种肿瘤的发生、发展密切相关。p53在近50%的肿瘤中发生突变,在致癌信号传导中起着重要作用。关于p53抑制肿瘤的生理功能的研究主要有两方面,一是p53通过抑制细胞分裂,将细胞停留在细胞周期的G1期,从而抑制肿瘤生长;另一方面,p53可以参与细胞凋亡和自噬,从而抑制肿瘤进展。当前主要有三种治疗肺癌的基因治疗法,分别是抑癌基因治疗法、免疫基因治疗法以及自杀基因治疗法,其中p53在抑癌基因治疗法中起着不可或缺的作用。p53基因已经被应用于临床上作为基因治疗的主要试验基因之一,因此,继续深入研究p53在肺癌中的分子机制及与之相关的癌基因具有重要临床意义。DRAM2是新发现的DRAM的同源蛋白,又被称为TMEM77。DRAM是抑癌基因p53介导的细胞凋亡和自噬的关键调控因子,跨膜蛋白DRAM2与DRAM一样都有六段跨膜区域,都参与细胞的自噬和凋亡,且共定位于溶酶体。同时DRAM2作为TMEM家族的成员之一,和其他TMEM家族成员一样能在自噬中发挥作用。近年来关于DRAM2在自噬中的研究越来越多,其在自噬中的作用也逐渐清晰,但其在肿瘤中的作用仍有待研究。因此,在本研究中,我们旨在阐明DRAM2在非小细胞肺癌进展中的表达和功能,以及DRAM2与p53在非小细胞肺癌中的关系,这可能为肺癌的调节机制和新的治疗靶点提供有价值的见解。研究方法:1.本研究通过免疫组织化学染色方法分析了DRAM2与临床病理的相关性。选取从2014-2017年在中国医科大学附属第一医院进行手术的256例肺癌患者的病理组织切片进行免疫组化染色,根据切片的染色强度和染色细胞所占百分比进行半定量计分评价,并对评价结果采用软件SPSS 16.0中的单样本配对t检验分析与临床相关因素的关系,主要侧重分析DRAM2的表达水平与患者性别、年龄、非小细胞肺癌病理组织分型、肿瘤分化程度、肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移、肿瘤TNM分期的统计学关系。界定标准为p值是否小于0.05,只有小于0.05才具有统计学意义。2.选取15对尚未用福尔马林固定的非小细胞肺癌肿瘤组织以及其对应的癌旁正常肺组织,分别提取RNA后进行real-time PCR实验,检测DRAM2在非小细胞肺癌组织的mRNA水平的表达量和正常组织的表达量,利用SPSS 16.0软件的配对样本t检验方法分析在癌和癌旁中DRAM2的mRNA水平的表达是否具有差异性。3.选择七种常用的非小细胞肺癌的细胞系,按照中科院上海细胞库官方网站公开的培养基配方配置培养基,将细胞株倒入无菌培养瓶中,加入适量的培养基,再将培养瓶放入含5%CO₂的孵箱内进行细胞培养,在无菌六孔板中进行细胞转染处理,所有换液、传代、冻存、转染等操作均在超净台中无菌操作完成。用蛋白免疫印迹法和real-time PCR法分别检测DRAM2以及其他相关蛋白在细胞系中的表达。4.将细胞系铺于提前铺好细胞爬片的无菌24孔板中,正常培养,等待细胞在爬片上贴壁之后,取出24孔板,用预冷的PBS清洗细胞表面,接下来用4%多聚甲醛固定15分钟,弃多聚甲醛后加入PBS静置5分钟洗去表面残留的多聚甲醛,重复清洗3次,接下来弃PBS加入0.1%Triton X-100静置15分钟使核膜打孔,弃去Triton X-100后用PBS清洗3次,再用非免疫胎牛血清蛋白封闭两个小时,弃血清后用目标DRAM2抗体在4℃孵育过夜,再次用PBS洗去多余的抗体,再用绿色荧光二抗避光孵育两个小时,再次用PBS洗去多余的抗体,接下来在避光条件下加入DAPI使细胞核染色,最后在荧光显微镜下观察激发相应的荧光后DRAM2在各种细胞系中的核浆定位情况,及时拍照记录。5.选取肺腺癌细胞A549细胞和肺鳞癌细胞SK细胞利用Lipofectamine 3000分别向细胞内转入DRAM2的质粒和siRNA,达到目标蛋白DRAM2的上调或下调的目的,以便接下来进行细胞功能学实验。6.在无菌细胞六孔培养板中用上述方法上调或是下调目标蛋白DRAM2的表达,转染24小时后进行细胞计数,每组计数相同的细胞数量铺于transwell小室的上室,在小室下室铺高于上室培养基血清浓度的培养基,形成营养梯度,20-24小时后取出transwell小室,用PBS洗净,用冰甲醇固定,用苏木素染色,再用棉签轻轻拭去上室的细胞,在显微镜下拍照计数下室细胞,以便后期确定细胞数目,用以确定DRAM2对细胞迁移能力的影响。7.在无菌细胞六孔培养板中上调或是下调目标蛋白DRAM2的表达,转染24小时后进行细胞计数,设计相同的重复孔作为复孔,每组计数相同的细胞数量接种到96孔培养板中,每次铺五个板,再正常培养,次日开始每天定时取出一个96孔板加MTT,检测吸光光度值,做好记录,连续五天相继测完5个板,最后分析DRAM2对细胞连续增殖能力的影响。8.在无菌细胞六孔培养板中上调或是下调目标蛋白DRAM2的表达,24小时后进行细胞计数,每组计数相同的细胞数量并设计相同的重复复孔,将细胞接种到新的无菌六孔培养板中,正常培养10天左右,等待肉眼可以看到合适的细胞集落形成后取出培养板,用PBS洗净后,用冰甲醇固定,再用苏木素染色,最后拿去拍照,以便于计数集落形成的数量,用于分析DRAM2对细胞集落形成能力的影响。9.在无菌细胞六孔培养板中上调或是下调目标蛋白DRAM2的表达,48小时后进行细胞的收集,用PBS洗净、再用75%冰乙醇固定过夜、次日用RnaA酶和PI处理,再用流式细胞仪分析细胞周期,分析DRAM2对细胞周期的影响。10.在A549、SK细胞中上调和下调目标蛋白DRAM2后通过蛋白免疫印迹实验检测与细胞增殖和迁移相关的蛋白变化以及p53及其下游蛋白的变化,选择A549和H1299上调p53后检测DRAM2的表达,验证DRAM2和p53之间的相互作用。最后通过p53过表达的H661细胞和p53缺失的H1299细胞再次检测DRAM2上调和下调后细胞增殖和迁移能力的变化,验证DRAM2是否通过p53信号通路发挥作用。结果:1.DRAM2在临床肺癌病例的肺癌组织中的表达水平高于癌旁正常肺组织,且DRAM2表达水平与肿瘤淋巴结转移、TNM分期的关系有统计学意义,而与患者的年龄、性别、非小细胞肺癌肿瘤分型、肿瘤分化程度以及肿瘤大小之间没有明显的统计学意义。在mRNA水平上,real-time PCR结果显示DRAM2在肺癌组织中表达也高于正常肺组织,在蛋白水平,蛋白免疫印迹结果也显示DRAM2在肺癌组织中的表达高于正常肺组织。2.细胞免疫荧光结果显示DRAM2在细胞浆内核周围分布,其在肺癌细胞系中的表达高于正常支气管上皮细胞的表达。3.Transwell结果显示DRAM2能够促进非小细胞肺癌的迁移能力,并且正向调控与迁移功能相关的蛋白如ROCK1、RAC1、RHOA、RHOB、RHOC的表达量。4.细胞周期结果、MTT结果、集落形成实验结果显示DRAM2能够促进非小细胞肺癌的增殖,并且正向调控与增殖功能相关的细胞周期蛋白CyclinD3、细胞周期蛋白依赖激酶CDK4和细胞周期抑制蛋白p27的表达量。5.在肺癌细胞系A549和SK中上调DRAM2的表达能抑制p53的表达,下调DRAM2能促进p53的表达。在细胞系A549和H1299中上调p53的表达也抑制DRAM2的表达。6.在p53高表达的细胞系中,目标蛋白DRAM2的上调和下调并不能够影响非小细胞型肺癌的迁移和增殖,但在p53缺失的细胞系中,目标蛋白DRAM2的上调和下调依然能改变非小细胞型肺癌的迁移和增殖能力。结论:1.DRAM2定位于细胞浆,在非小细胞肺癌组织中以及细胞系中高表达,且具有临床意义2.DRAM2促进非小细胞肺癌细胞的迁移和增殖能力3.DRAM2和p53的表达相互抑制4.DRAM2通过抑制p53促进非小细胞肺癌的迁移和增殖,但p53缺失时DRAM2也可以发挥促癌作用