前言:　　 氨基酸是中枢神经系统(Ccntral nervous system,CNS)数量最多,分布最广的神经递质,在众多的氨基酸中常见的神经递质有γ-氨基丁酸(γ+aminobutyricacid,GABA),谷氨酸(Glutamate,Glu),甘氨酸(Glycine,Gly)和牛磺酸(Tamine,Tau)。根据对CNS作用的不同,氨基酸类神经递质可分为两类:兴奋性氨基酸(Excitatory aminoacid,EAA),主要包括Glu;抑制性氨基酸(Inhibitory amino acid,IAAl),包括GABA,Gly和Tau,其中主要是GABA。已有证据表明,脑中的许多氨基酸浓度在癫痫发作时发生了明显的改变。突触小体是一个游离的突触前末端,它是脑组织在等渗溶液中匀浆时,神经末梢在剪切力的作用下从轴突上断裂下来,自发封闭形成的独立结构。据报道,突触小体内的氨基酸直接参与到神经元信息的传递中,而且相对于全脑组织来说,突触小体内氨基酸浓度的改变对癫痫发作的影响更相关。　　 GABA是哺乳动物CNS中最主要的抑制性神经递质之一,它能介导抑制性突触传递作用。目前大量研究表明,中枢神经系统内GABA能抑制作用减弱或缺乏是导致癫痫发生过程中神经元兴奋性增高的重要原因。　　 突触间隙中GABA降解的唯一途径只能通过膜上的γ-氨基丁酸转运体(GAT)的重摄取来实现。GAT包括浆膜GAT和囊泡GAT(VGAT)。分子克隆技术发现,大鼠浆膜GAT包括四种转运体亚型,即GAT-1,GAT-2,GAT-3和GAT-4(或称BGT-1)。目前有文献证实GAT-1和GAT-3是海马中含量最丰富的两种GAT亚型,且最有可能通过调节突触间隙中的GABA浓度从而导致癫痫的发生。　　 配体门控的氯离子通道受体γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)可以调节绝大多数GABA能抑制性突触传递作用。GABAAR是一种17个亚单位(包括α1-α6,β1-β4,γ1-γ4,δ,ε,π,θ及ρ1-ρ3)以不同方式组合形成的五聚体离子通道结构,其中α1是成熟神经元表达最多的亚单位之一,对于γ2来说,超过80%的GABAAR含有此亚单位。GABAAR不同亚单位组合可形成两种不同的抑制,即时相抑制性突触传递和紧张性外周突触抑制,其中包含α1和γ2亚单位的受体主要位于突触内并且参与时相性突触抑制,而包含α4亚单位的GABAAR主要定位于突触外并且参与海马的紧张性突触抑制。此外,GABAAR介导的快速超极化抑制主要依赖于细胞内的低Cl-浓度,钾氯共转运体二亚型(KCC2)可以将神经元内Cl"转运至胞外,从而产生GABAAR介导的超极化电流。　　 星形胶质细胞是一种非常常见的胶质细胞,它在调节脑中的突触传递中具有非常重要的作用。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的一种主要成分,在癫痫发生过程中,GFAP蛋白表达的改变和星形胶质细胞的病理性改变密切相关。　　 遗传性癫痫大鼠模型Tremor大鼠(TRM)出生8周后自发性地出现癫痫小发作,它的发作无需外加物理化学因素刺激,是研究遗传性癫痫的理想动物模型。迄今为止,还未见到应用高效液相色谱仪(HPLC)测定TRM海马突触小体内GABA,Glu,Gly和Tau含量的报道;有关TRM海马内GAT-1,GAT-3,GABAARα1,GABAARα4,GABAARγ2亚单位及KCC2的研究仍为空白。此外,尽管最近研究表明KCC2的表达在匹鲁卡品诱导的癫痫模型和难治性癫痫患者中具有明显改变,但是对于癫痫发生过程中KCC2改变的具体调节机制仍不清楚。同时,虽然目前有研究发现癫痫发生过程中GFAP蛋白存在明显的改变,但是对于癫痫相关的反应性胶质细胞增生的具体机制还不十分明确。因此,本研究拟采用RT-PCR,实时定量RT-PCR,免疫组化和免疫印迹技术研究TRM海马中GAT-1和GAT-3在mRNA和蛋白层面的表达情况;同时采用实时定量RT-PCR和免疫印迹方法研究TRM海马中GABAARRα1,GABAARα4,GABAARγ2亚单位及KCC2在mRNA与蛋白两个层面的表达情况;此外,我们采用免疫荧光技术、免疫组化技术和免疫印迹法研究TRM海马中GFAP蛋白的分布与表达,以期明确GABA能抑制性突触传递通路在癫痫发生中的角色与作用。　　 实验方法:　　 一、突触小体完整性检测　　 参照试剂盒说明书测定海马突触小体乳酸脱氢酶活性。　　 二、HPLC分析　　 二元梯度洗脱将海马突触小体中的氨基酸分离。峰面积进行定量。　　 三、RT-PCR分析　　 提取海马总mRNA,参照试剂盒说明书进行实时RT-PCR操作。分析平均光密度值确定GAT-1mRNA和GAT-3mRNA的相对表达。　　 四、实时定量RT-PCR分析　　 提取海马总mRNA,参照试剂盒说明书进行实时定量RT-PCR。标准曲线法进行定量,检测海马GAT-1mRNA,GAT-3mRNA,GABAARα1mRNA,GABAARα4mRNA,GABAARγ2mRNA和KCC2mRNA表达。　　 五、免疫荧光分析　　 免疫荧光技术对海马各区(包括CA1、CA3和齿状回(Dentategyrus,DG)区)GFAP蛋白进行初步定位。　　 六、免疫组化分析　　 脑组织进行常规做冰冻切片。用图像分析系统测定各组海马CA1,CA3与DG区GAT-1、GAT-3和GFAP免疫反应的平均光密度值。　　 七、免疫印迹分析　　 提取海马组织总蛋白,ECL显影后分析GAT-1,GAT-3,GABAARα1,GABAARα4,GABAARγ2,KCC2和GFAP蛋白的表达。　　 结果:　　 一、海马突触小体的完整性检测　　 海马突触小体的完整性用乳酸脱氢酶的活性来评价。正常组在温育前后,海马突触小体悬液中乳酸脱氢酶活性显著高于上清液中乳酸脱氢酶活性(beforeincubation:25.87±1.41 in suspension of control rats vs 5.26±0.91 in supematant of controlrats,p＜0.01:afterincubation:26.18±1.25 in suspension of control rats vs5.4±0.85i nsupematant of controlrats,p＜0.01),且比例均维持在约5:1不变;此外,TRM组在温育前后,海马突触小体悬液中乳酸脱氢酶活性也显著高于上清液中乳酸脱氢酶活性(before incubation:26.75±1.63insuspension of TRMsvs 5.08±1.05 insupcrnatant of TRMs,p＜0.01;afterincubation:26.93±1.36insuspension of TRaMsvs5.21±1.17insupematant of TRMs,p＜0.01),且比例也都维持在约5:1不变。　　 二、HPLC测定结果　　 TRM海马突触小体内的Glu含量明显高于正常组(132.33±2.00inTRMsvs107.90±3.98incontrolrats,p＜0.01);而对于GABA,Gly和Tau来说,其在TRM海马突触小体内的含量均明显低于正常组(GABA:59.55±6.38inTRMsvs102.36±21.90incontrolrats,p＜0.01;Gly:1139.85±76.50inTRMsvs1345.49±115.25incontrolrats,p＜0.01;Tau:70.79±2.01inRMsvs107.72±2.41 incontrolrats,p＜0.01)。　　 三、RT-PCR结果　　 GAT-1mRNA在TRM海马中的表达明显高于正常大鼠(0.72±0.13inTRMsvs0.43±0.04incontrolrats,P＜0.01);此外,与正常组比较,TRM海马中GAT-3mRNA的表达也显著增加(0.83±0.17inTRMsvs0.61±0.04incontrolrats,P＜0.05)。　　 四、实时定量RT-PCR结果　　 TRM海马GAT-1mRNA的表达显著高于正常对照组(1.58±0.42inTRMsvs0.45±0.33incontrolrats,P＜0.01);此外,相对于正常组来说,GAT-3mRNA在TRM海马中的表达也明显增加(1.40±0.13inTRMsvs0.77±0.29incontrolrats,P＜0.05);TRM海马中GABAARα1mRNA和GABAARα4mRNA的表达均显著高于正常大鼠(GABAARα1:2.0±0.57inTRMsvs0.90±0.41incontrolrats,P＜0.01;GABAARα4:1.74±0.43inTRMsvs0.74±0.22incontrolrats,P＜0.01);但是,GABAARγ2mRNA和KCC2mRNA在TRM海马中的表达均显著低于正常对照组(GABAARγ2:0.63±0.10inTRMsvs1.64±0.23incontrolrats,P＜0.01;KCC2:0.75±0.16inTRMsvs1.88±0.36incontrolrats,P＜0.01)。　　 五、免疫荧光结果　　 GFAP蛋白在TRM和正常大鼠海马CA1,CA3和DG区均有表达。　　 六、免疫组化结果　　 GAT-1蛋白在正常大鼠和TRM海马的CA1,CA3和DG区中均有明显分布,且在TRM海马的CA1,CA3和DG区中的整合光密度值均比在正常大鼠中明显;而对于GAT-3来说,只在大鼠海马的CA1区中表达丰富,在海马的CA3区和DG区只有微弱的表达,同时,和正常大鼠比较,TRM海马CA1区中GAT-3蛋白的整合光密度值明显增加;GFAP蛋白免疫反应性的阳性细胞在正常大鼠和TRM海马CA1,CA3和DG区均有表达。TRM海马CA1,CA3和DG区的GFAP蛋白免疫反应性的整合光密度值均显著高于正常组。　　 七、免疫印迹结果　　 TRM海马中GAT-1蛋白的表达显著高于正常大鼠(0.64±0.06 inTRMsvs0.32±0.10 incontrolrats,P＜0.01);此外,TRM海马中GAT-3蛋白的表达也显著高于正常组(0.94±0.06inTRMsvs0.51±0.15inconntrolrats,P＜0.01)。综上,TRM海马中GAT-1和GAT-3蛋白表达确实上调。TRM海马中GABAARα1和GABAARα4蛋白的表达均显著高于正常大鼠(GABAARα1:0.75±0.08inTRMsvs0.44±0.05incontrolrats,P＜0.01;GABAARα4:1.13±0.04inTRMsvs0.77±0.06 incontrolrats,P＜0.01);然而,GABAARγ2和KCC2蛋白在TRM海马中的表达均显著低于正常组(GABAARγ2:0.85±0.01inTRMsvs1.19±0.05incontrolrats,P＜0.01;KCC2:1.38±0.10inTRMsvs1.84±0.09incontrolrats,P＜0.01);与此同时,TRM海马中GFAP蛋白的表达显著高于正常组(1.26±0.17inTRMsvs0.82±0.13incontrolrats,p＜0.01)。　　 结论:　　 1、首次应用HPLC法同时测定TRM海马突触小体内GABA、Glu、Gly和Tau的含量。TRaM中GABA和Tau显著降低及Glu显著增加,可能会促进神经元兴奋性增加,引发癫痫样放电;而TRM中Gly显著降低,可能是癫痫发生后的一种代偿性保护机制。　　 2、首次证实,与正常对照组比较,TRM海马GAT-1和GAT-3在mRNA和蛋白水平表达上调。　　 3、首次证实,与正常对照组比较,TRM海马GABAARα1和GABAARα4,在mRNA和蛋白水平表达上调;TRM海马GABAARγ2和KCC2在mRNA和蛋白水平表达下调。　　 4、首次证实TRM海马GFAP蛋白显著上调,提示癫痫的发生过程中,可能存在星形胶质细胞增生的现象。　　 5、TRM海马GAT-1和GAT-3在mRNA与蛋白水平表达上调,可能会促进神经元兴奋性增加,引发癫痫样放电,进而构成TRM癫痫表型的发作基础。　　 6、TRM海马GABAARα1和GABAARα1在mRNA与蛋白水平表达上调,可能会抑制神经元的兴奋性,提示可能是癫痫发生后的一种代偿性保护机制;TRM海马GABAARγ2和KCC2在mRNA与蛋白水平表达下调,可能会促进神经元兴奋性增加,引发癫痫样放电,进而构成TRM癫痫表型的发作基础。　　 7、TRM作为一种非常好的癫痫动物模型,可用于筛选GAT及GABAAR特异性药物并应用于基因治疗。　　 8、本研究结果在解释遗传性癫痫海马GABA能抑制性突触传递通路改变上具有重要意义。