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黑曲霉(Aspergillus niger)作为GRAS(generally recognized as safe)认证的菌株,具有高效的蛋白质分泌能力,是工业生物技术中蛋白表达的平台微生物之一。微生物细胞表面展示酶在生物催化和生物转化制造生化产品等方面表现出优秀的性能,是绿色生物制造领域的新兴研究热点。虽然真菌细胞壁的主要成分(糖蛋白、葡聚糖和几丁质)基本相同,但丝状真菌与酵母在液体深层发酵过程中的生理特性以及细胞壁依然有差异。不同来源的壁蛋白作为锚定模块在黑曲霉细胞表面功能性展示脂肪酶的可行性、以及不同微生物细胞作为载体展示脂肪酶的催化特性差异尚需探讨。本论文利用不同来源的锚定蛋白构建了黑曲霉表面展示脂肪酶全细胞催化剂,并对黑曲霉表面展示脂肪酶的催化特性进行表征,以期进一步诠释非水相反应体系中微生物细胞表面展示脂肪酶-底物-反应体系的作用关系,为开发微生物细胞表面展示脂肪酶全细胞催化剂在绿色生物制造领域的潜在应用提供理论和技术基础。具体研究内容及结果如下:为了满足食品级酶制剂的要求,本文利用GRAS认证菌株的表达元件和不同壁蛋白构建了黑曲霉表面展示脂肪酶全细胞催化剂。将来源于Aspergillus nidulans的筛选标记amd S、A.niger内源的强启动子Pgla(包含糖化酶的信号肽和前导肽)、Aspergillus oryzae的终止子TagdA、pUC19上含有AMP、Ori等克隆载体基本元件的骨架片段连接,从头构建了黑曲霉表面展示基础质粒pUAGA。将C端添加有FLAG标签的CALB与A.niger内源的壁蛋白CwpA融合,实现了CALB在黑曲霉菌丝表面的活性展示。将C端添加有FLAG标签的CALB与来源于酿酒酵母的异源壁蛋白SED1融合,也实现了CALB在黑曲霉菌丝表面的活性展示。采用基因组PCR和PCR产物测序、重组菌发酵脂肪酶活性检测、激光扫描共聚焦显微镜免疫荧光检测,确证重组菌A.niger/CALBCwpA和A.niger/CALB-SED1构建成功。以麦芽糖作为碳源,诱导48h后,重组菌A.niger/CALB-CwpA菌丝表面的脂肪酶水解活力最高可达到400 U/g of dry cell,重组菌A.niger/CALB-SED1菌丝表面的脂肪酶水解活力最高可达到440.30 U/g of dry cell。以上结果表明,CwpA和SED1都可以作为锚定模块在黑曲霉菌丝表面展示功能蛋白。为了评估黑曲霉表面展示脂肪酶在非水相酯化反应中的催化特性,本文利用黑曲霉表面展示CALB在无溶剂体系中合成一系列脂肪酸酯。重组A.niger/CALB-CwpA全细胞催化剂能有效地催化不同碳链长度的脂肪酸与乙醇的酯化反应。反应时间分别为2h、2h、3h,己酸、月桂酸、硬脂酸的最大摩尔转化率分别可达到87%、89%、84%。适当增加反应体系的初始水添加量可以显著提高菌丝表面展示脂肪酶的酯化活性,缓解乙醇对酶分子“必需水”的剥夺效应。对于合成己酸乙酯、月桂酸乙酯和硬脂酸乙酯,使用30%的初始水添加量(基于脂肪酸摩尔数的百分比),酯化反应的初始反应速率分别是使用3%的初始水添加量的反应的3.53倍,6.89倍和9.58倍。脂肪酸碳链长度越长,初始水添加量对酯化反应的影响越显著。在合成硬脂酸乙酯时,当初始水添加量为3%,出现明显的反应“滞后”现象。反应过程中生成的水对脂肪酶酯化反应的前期能起到推动作用。而在无溶剂体系合成异丙酯时,低的初始水添加量并未引起初始反应速率的急剧下降,没有形成一个显著的反应“滞后”现象,适当增加水量也可增大初始反应速率。在无溶剂反应体系中,酯化反应形成的水吸附于黑曲霉菌丝表面,导致A.niger/CALB-SED1全细胞催化剂在下一批次的反应效率下降。丙酮洗涤使其具有良好重复使用稳定性。重复使用到第5批次时,月桂酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯的最大产率仍能分别保持在第1批次时转化率的99.79%、99.10%、96.83%。以上结果表明,黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂在非水相酯化体系中具有较高的合成活性和良好的操作稳定性。为了评估黑曲霉表面展示脂肪酶在非水相转酯反应中的催化特性,本文利用黑曲霉表面展示CALB乙醇解磷脂酰胆碱(PC)制备甘油磷脂酰胆碱(GPC)。重组A.niger/CALB-CwpA全细胞催化剂能有效地醇解PC制备GPC。以2mL异辛烷作溶剂,PC 12mg/ml,底物摩尔比7:1(乙醇/PC),A.niger/CALB-CwpA全细胞催化剂20mg/mL,0h添加的去离子水为底物总质量的40%,60°C 200r/min,反应12h,PC的转化率和GPC的产率分别为96.32%和94.48%。在底物摩尔比为50:1到200:1的范围内,随着乙醇过量程度的加大,黑曲霉菌丝表面展示CALB在高极性的反应体系中对甘油三酯呈现sn-1,3位置选择性,导致积累中间产物LPC。GPC是一种极强的亲水性物质,会吸附在黑曲霉菌丝表面。采用叔丁醇/甲醇=4/3的混合溶剂洗涤既可实现对每批次反应产物GPC的有效回收,也可保持A.niger/CALB-CwpA菌丝表面展示脂肪酶的转酯活性。连续反应9个批次后,PC的转化率和GPC的产率仍能维持在94.45%和89.79%。以上结果表明,黑曲霉表面展示CALB全细胞催化剂在非水相转酯体系中具有较高的转酯活性和良好的操作稳定性。