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结核病(Tuberculosis,TB)在全球范围内广泛地引起人和动物发病甚至死亡,引发重大的经济损失。早期准确诊断和对活动性肺结核病人的及时治疗,减少结核发病率及降低死亡率非常重要。在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染者中,超过95%表现为潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI),若在HIV感染或自身免疫性疾病致使机体免疫力低下情况下,LTBI日后可发展成为活动性结核,成为主要的传染源,因此TB感染及时检测对于控制结核病至关重要。目前应用最为广泛的诊断方法是结核菌素试验(tuberculin skin test,TST),该诊断方法是一种以纯化蛋白衍生物(PPD)或旧结核菌素(OT)为抗原进行皮下注射的诊断方法,其特异性较差,诊断结果假阳性率较高。因此迫切需要研究开发出特异性好、便于临床应用的鉴定方法。近年来引人注目的是对于结核分枝杆菌特异性抗原诊断价值的研究进展,因为比较基因组学提供了大量特异性抗原信息,并发现了16个MTB特异性差异区域(RD)。因此本研究选取RD2区域中的5种蛋白进行原核融合表达与纯化,对它们免疫特性进行了初步分析,并对其牛结核血清学诊断价值进行比较研究。1.结核分枝杆菌RD2区五种抗原蛋白的原核表达、纯化和鉴定选取MTB RD2区5种蛋白Rv1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986和Rv1988作为研究对象,利用PCR扩增了相应的编码基因,经克隆筛选和测序鉴定正确后,利用pEASY-E1、 pET-30a(+)及pET-32a(+)质粒构建原核表达质粒。鉴定正确的表达质粒转化进原核表达菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示诱导后各目的蛋白均得到成功表达,对可溶形式表达的融合蛋白直接进行镍柱亲和层析纯化,对以包涵体形式表达的融合蛋白在进行变复性后进行镍柱亲和层析纯化。Western-blotting结果表明,在使用抗His单抗及兔抗TB多抗血清反应后都出现了特异性目的条带,表明融合蛋白具有较高的免疫反应性。同时,对这几种分子的深入研究提供了条件。2.融合蛋白免疫原性分析及其牛结核诊断价值评价取Rv1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986四种融合蛋白分别皮下免疫C57BL/6小鼠,100μg/只,每次免疫间隔两周,于二免二周后取脾脏淋巴细胞进行免疫学试验。利用夹心ELISA试验检测四种蛋白作为刺激抗原活化淋巴细胞分泌IFN-y、IL-2和IL-4水平,结果显示：Rv1985与Rv1983刺激细胞产生IFN-y的能力最强,Rv1981刺激细胞产生IL-4的能力最强,而产生IFN-y能力在所有蛋白中最弱。为评价上述蛋白抗原在牛结核血清学诊断中的潜能,我们进行了刺激试验：将Rv1981、 Rv1983、Rv1985、Rv1986四种融合蛋白纯化产物作为包被抗原,通过间接ELISA方法检测临床采集牛血浆上清中特异性抗体,结果显示阳性符合率分别为：Rv1981为22%(15/68)、Rv1983为35.3%(24/68)、Rv1985为36.7%(25/68)及Rv1986为32.4%(22/68)。四种蛋白中,Rv1985与Bovine PPD有较高的协同性,显示该蛋白拥有较高诊断潜能。此后将上述四种融合蛋白纯化产物作为刺激剂刺激奶牛外周血,IFN-y检测试剂盒检测其活化抗原特异性细胞产生IFN-y水平,检测的阳性符合率分别为30%(6/20)、20%(4/20),50%(10/20)及35%(7/20),显示在牛结核血清学检测中,该四种蛋白具有一定应用潜能。