多糖是一种重要的天然化合物,根据其来源不同,可分为动物多糖、植物多糖和微生物多糖。到目前为止,虽然国内外对多糖的研究日益重视,但就其研究的层次和水平来说,与蛋白质和核酸相比还有很大的差距;与植物和动物多糖相比,微生物多糖在医药领域的应用更为滞后。本实验室前期在链霉菌139中分离得到一种新型胞外多糖依博素,具有显著的抗类风湿性关节炎及抗银屑病活性,是在链霉菌中首次发现的具有药理活性的胞外多糖。该多糖包括27个生物合成基因（ste1-ste27）,序列分析ste1可能为胞外多糖依博素生物合成的负调控基因;将依博素生物合成基因簇中ste1阻断后,发现依博素的产量明显提升,但Ste1调控胞外多糖生物合成的具体机制尚未完全阐明。通过序列比对分析发现,Ste1与天蓝色链霉菌中的全局调控蛋白DasR具有高度同源性。全局调控蛋白DasR是平衡链霉菌中碳源和氮源代谢的交叉点,通过与中间代谢产物GlcNAc-6P和GlcN-6P结合,在介导链霉菌营养感应、形态分化、初级和次级代谢转换等方面发挥着重要作用。虽然DasR类蛋白能调控天蓝色链霉菌中所有已知抗生素的生物合成,且在放线菌如红色糖多孢菌等中也有其调控抗生素生物合成的报道,但DasR类蛋白与多糖合成调控相关的研究除本实验室外未见报道。据此,本课题在前期已经获得ste1阻断株的基础上,重点从Ste1调控链霉菌139中的氨基糖初级代谢和次级代谢之间的相关性进行研究,特别是调控胞外多糖依博素生物合成等方面。研究共包括以下三部分:本课题的第一部分使用高效液相色谱法分别测定了链霉菌139野生株及其ste1阻断株对不同糖（Glc、GlcNAc、（GlcNAc）2）的利用速率,发现阻断ste1后链霉菌139利用N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）的速率明显下降,但对葡萄糖（Glc）和N,N’-二乙酰基壳二糖（（GlcNAc）2）的利用速率无明显变化,该研究结果与天蓝色链霉菌中DasR调控GlcNAc一致。随后对链霉菌139野生株及其ste1阻断株进行转录组测序,测序结果中包含6848个基因,其中100个基因的表达水平有显著变化,显著上调的有15个,显著下调的有85个。对显著变化的基因进行功能分类,发现其功能主要与代谢相关,尤其是与氨基糖代谢相关。在显著上调基因中有几丁质酶基因S139GL004512（F3L20RS21775）和PTS N-acetylglucosamine transporter subunit EIIA编码基因S139GL002188（F3L20RS10900）,分别对应氨基糖分解和转运;显著下调基因有编码多糖去乙酰酶基因S139GL000716（F3L20RS03630）,有意思的是,这些基因中均包含DasR蛋白结合的特征性序列,为下一步研究指出了方向。根据上述结果,本课题的第二部分是纯化获得Ste1与DasR两个重组蛋白;之所以把获得重组蛋白此项工作单独列为一部分,是因为这两个蛋白不但可溶性表达量低,且纯化也非常困难。我们使用了三种不同系列的质粒来构建表达载体,包括pET28a（组氨酸标签）、pGEX-4T1（GST标签）和pCold（助溶载体,组氨酸标签）,其中在pET系统中尝试了N端标签、C端标签和双末端标签均未成功,最终利用pCold助溶载体在大肠杆菌中纯化得到了较高纯度的Ste1与DasR蛋白,用于第三部分的凝胶阻滞实验。随后在第三部分中,结合转录组测序比较ste1阻断株中变化明显的基因,通过在链霉菌139基因组中搜索dre序列（DasR蛋白结合特征序列）,确定了 13个候选研究基因。研究主要发现了 Ste1蛋白可特异结合氨基糖代谢相关几丁质酶基因（F3L20RS21775）、PTS N-acetylglucosamine transporter subunit EIIA编码基因（F3L20RS10900）以及与多糖修饰降解相关的多糖去乙酰酶基因（F3L20RS03630）,说明Ste1可能联系氨基糖代谢和胞外多糖的聚集。此外,还发现能与Ste1结合的序列与DasR并不完全相同,二者具体调控模式的差异有待后续研究。因在实验期间遇到的疫情和蛋白纯化等困难,本研究未形成一个完整的闭环;但建立了分析及筛选与Ste1和DasR蛋白结合的靶基因片段相关实验方法,确定了6个受Ste1调控的基因,为后续对链霉菌139生物改造获得依博素高产菌株以及链霉菌中氨基糖代谢和多糖合成相关的调控网络研究提供了参考和基础。