钉螺作为日本血吸虫的唯一中间宿主,它们的分布与血吸虫流行区一致。在钉螺血淋巴中负责氧运输的是一种细胞外的大分子蛋白质—血蓝蛋白(Hc)。目前,有关钉螺血蓝蛋白的研究还未见报道,从分子层面上研究钉螺血兰蛋白,可望为血吸虫防治新技术的研发提供实验依据和理论指导。本文系统研究了钉螺血兰蛋白的提取和纯化方法,并对其结构和性质进行了初步探讨。本实验通过超高速冷冻离心和Sepharose 4B凝胶过滤柱层析法从湖北钉螺血淋巴中提取、纯化了血蓝蛋白。采用紫外吸收光谱法测定了钉螺血蓝蛋白340nm处的特征吸收峰,利用原子吸收光谱法测得其铜含量为0.23%。透射电子显微镜研究结果证实其四级结构为中凹的圆柱体,且以单体、二聚体、多聚体共存于血淋巴中。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其蛋白质亚基成分,发现有2种蛋白质亚基成分,与蛋白质分子质量标准比较,有-条位置接近400KDa,一条接近250KDa。大量研究事实表明,软体动物及节肢动物的血蓝蛋白与酚氧化酶(PO)虽然功能不同,但在结构上均具有铜氧结合位点,且在特定的条件下,血蓝蛋白又能转化为酚氧化酶样酶(HdPO)而表现出PO活性。实验中利用体外激活剂对钉螺血蓝蛋白的激活结果显示,胰肽酶E和尿素能非常有效地将Hc转化为HdPO,0.1% SDS对Hc的激活作用很弱。为此,本研究中选用2M尿素来激活Hc纯品使之成为HdPO,并以邻苯二酚为特异性底物对其HdPO生物化学性质进行了研究。研究结果表明,HdPO对邻苯二酚底物的最适反应pH值约为7.0和9.0,最适温度约为40℃, Km值约为2.69 mmol/L。底物特异性研究还发现此HdPO不仅对邻苯二酚具有氧化活性,对酪氨酸底物也具有氧化活性,且对酪氨酸的Km值约为9.52mmol/L,说明该酶既具有酪氨酸酶活性,又具有儿茶酚酶活性。此外,HdPO对金属离子鳌合剂乙二胺四乙酸(EDTA)非常敏感,其酶活性能被EDTA强烈抑制,但Ca2+、Mg2+、K+、Na+对酶活性的影响很小。通过ELISA实验确定钉螺血蓝蛋白与日本血吸虫具有共同抗原表位,并对ELISA相关条件进行了优化,为血蓝蛋白的免疫学检测方法奠定了基础。最终确定抗原浓度为50 ng/ml;血清稀释倍数为1:1000;BSA封闭时间为2h;酶标二抗的最佳反应浓度为1:20000,最佳反应时间为1h;底物四甲基联苯胺(TMB)的作用时间为15分钟。