论文部分内容阅读
背景心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是临床上的常见危急重症,尽管近年来由于冠状动脉再灌注治疗的广泛应用,已使心肌梗死的急性死亡率显著降低,但心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)作为心血管类疾病终末阶段的必然结局,其发展程度仍是决定疾病预后的重要影响因素之一。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)发生时,纤维化瘢痕的迅速形成可以帮助提高室壁硬度,防止心脏破裂;但由于心肌细胞再生修复能力有限,过度增生的瘢痕则会使心室顺应性下降,影响心肌正常的舒缩功能,从而引发心律失常、心力衰竭等各种恶性结局。在心肌纤维化进程中,多种生长因子和神经体液介质参与,其中血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factors,PDGF)就是心肌纤维化的重要介质之一,作为生长因子,PDGFs在发育过程中是间充质细胞的关键调节因子,并通过激活下游血小板源性生长因子受体(Platelet-derived growth factors receptor,PDGFR),促进伤口的修复愈合,还能通过刺激肌成纤维细胞(Myfibroblast)的转化和成纤维细胞(Fibroblasts)的增殖,从而诱导纤维化的发生。本团队所使用的益气活血药组方由当归补血汤化裁而来,方中由生黄芪、生晒参、川芎、当归、三七粉共五味中药组成,常年来在临床治疗心梗后心肌缺血等气虚血瘀型心血管疾病中取得比较满意的疗效。前期研究结果显示,益气活血药具有抗炎、改善冠脉微循环障碍、保护线粒体、调整心脏重构、神经重构等一系列心肌保护作用,在改善心肌纤维化的过程中,益气活血药对涉及纤维化的转化生长因子-β(TGF-β)以及经典Wnt信号通路的关键信号分子有下调影响,但PDGFs作为促进纤维化的重要介质,益气活血药是否可以通过调控PDGFs及其相关信号分子发挥抗纤维化、保护心肌组织的作用还尚不明晰。因此本研究依托于大鼠心肌梗死模型,进一步观察益气活血药对MI后MF大鼠不同亚型血小板源性生长因子的影响,以及对下游信号通路关键分子的调节作用,为探究益气活血药治疗MI后MF的作用机制提供实验依据。目的通过观察PDGFs及相关信号通路蛋白表达水平,探究不同亚型PDGFs在心肌纤维化中的作用,观察益气活血药抗纤维化的调控机制,以及是否与PDGFs/PDGGFRs途径相关,为益气活血药治疗心梗后心肌纤维化提供依据。方法选用健康雄性SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,结扎左前降支(LAD)建立心肌梗死大鼠模型,假手术组只穿线,不结扎。术后将成模动物随机分为假手术组、模型组、培哚普利组和益气活血组,每组9只,给予相应药物灌胃治疗28天后,采用超声心动图评价大鼠心脏结构和功能的变化,苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色观察心肌病理形态结构,马松(Masson)染色法观察药物对心肌纤维化的影响,蛋白质印迹法(Western blot)检测Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)、PDGFs、PDGFRs、ERK1/2、p-ERK1/2 的蛋白表达水平。结果实验一:益气活血药对心梗大鼠心功能的影响心脏功能超声结果:在心肌梗死28天后,模型组与假手术组相比较发现,LVEF和LVFS均显著降低(P＜0.01),LVIDs和LVIDd显著升高(P＜0.01);两用药组与模型组相比较发现,LVEF和LVFS均显著升高(P<0.01),LVIDs和LVIDd显著降低(P<0.01)。说明心肌梗死后,大鼠左室舒缩功能下降,心腔扩大,通过两用药组的药物干预可帮助恢复部分心功能。心肌组织病理改变:在心肌梗死28天后,镜下假手术组大鼠呈现规则的心肌细胞排列,大小基本整齐一致,细胞核呈蓝染,结构致密,染色清晰;模型组大鼠心肌细胞走形紊乱,梗死区可见肌质溶解呈网状,细胞核固缩溶解,残存部分可见细胞代偿性肥大,细胞间隙明显增宽,可见纤维素渗出;培哚普利组大鼠可见心肌细胞排列部分恢复序列,仍有部分间隙增宽,渗出明显减少;益气活血组大鼠心肌细胞排列较为整齐,间隙少许增宽。说明心肌梗死造成心肌组织形态发生严重的病理改变,两组用药组的药物干预可以保护心肌细胞,改善病理状态。实验二:益气活血药对心梗大鼠心肌纤维化的影响心肌组织胶原纤维和胶原容积分数的改变:在心肌梗死28天后,镜下观察假手术组心肌细胞呈红染,间质呈蓝染,可见少量胶原纤维;模型组心肌细胞红染较黯,梗死区可见广泛胶原纤维蓝染,弥漫性分布,间质见大量纤维束包绕心肌细胞,将其分隔成条形或小岛状,大血管周围可见较多胶原纤维染色存在;培哚普利组心肌细胞红染黯现象减轻,梗死区域蓝染面积较模型组缩小。益气活血组心肌细胞呈红染,蓝染的纤维化面积减小。计算心肌梗死28天后心肌胶原容积分数发现,模型组的胶原容积分数较假手术组显著升高(P＜0.01),两组用药组的结果较模型组显著下降(P<0.01)。说明心肌梗死后胶原纤维在梗死区域和梗死边缘区的血管周围沉积,两组用药组的药物干预可以减少胶原纤维的生成,缩小纤维瘢痕的面积。collagen Ⅰ和Ⅲ的蛋白表达改变:在心肌梗死28天后,模型组大鼠的collagen Ⅰ蛋白表达和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值升高(P＜0.05),collagenⅢ蛋白表达呈降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);两用药组的collagen Ⅰ蛋白表达和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值下降,其中益气活血组的差异具有统计学意义(P<0.01),collagenⅢ的蛋白表达则较模型组显著上升(P<0.01)。说明心肌梗死发生28天后,collagen I在心肌组织中沉积,Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的表达比例失调,造成心肌纤维化和心功能的降低,但两组用药组的药物干预可以减少collagen Ⅰ的表达,促进Ⅰ/Ⅲ型胶原比值的恢复。实验三:益气活血药对心梗后心肌纤维化大鼠PDGFs的影响PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D的蛋白表达改变:在心肌梗死28天后,与假手术相比,模型组大鼠PDGF-A和PDGF-C的蛋白表达显著下降(P<0.01),PDGF-B的蛋白表达显著上升(P＜0.01),PDGF-D未见明显差异(P>0.05)。与模型组相比,两用药组大鼠PDGF-A和PDGF-C蛋白表达均有上升,其中益气活血组PDGF-A的蛋白表达升高(P<0.05),培哚普利组和益气活血组大鼠PDGF-B蛋白表达均有下降(P＜0.05,P<0.01),PDGF-D未见明显差异(P>0.05)。说明不同亚型的PDGFs在心肌梗死后的表达并不一致,在疾病的发展过程中发挥不同的活性功能,其中PDGF-B参与了心肌纤维化的发生,益气活血药可以通过降低PDGF-B和上调PDGF-A的表达抑制心肌纤维化,发挥保护心脏的功能。实验四:益气活血药对心梗后心肌纤维化大鼠PDGFRs及ERK1/2的影响PDGFR-α和PDGFR-β3的蛋白表达改变:在心肌梗死28天后,与假手术相比,模型组大鼠PDGFR-α和PDGFR-β的蛋白表达显著上升(P<0.01),益气活血组大鼠PDGFR-α和PDGFR-β的蛋白表达下降(P<0.05)。说明益气活血药可以降低PDGFR-α和PDGFR-β的表达发挥抗纤维化的作用。ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达改变:在心肌梗死28天后,各组ERK1/2的蛋白表达未见明显变化(P>0.05),与假手术相比,模型组大鼠p-ERK1/2显著上升(P＜0.01),益气活血组大鼠的p-ERK1/2显著下调(P<0.01)。说明益气活血药抗心肌纤维化可以通过抑制ERK1/2的磷酸化表达来发挥作用。结论1.益气活血药能够保护心肌细胞,抗心肌纤维化并促进部分心功能的恢复。2.当心肌梗死发生后,不同亚型的PDGFs表达并不一致,PDGF-B有一定促进心肌纤维化的作用,而PDGF-A和PDGF-C可能在心肌保护中发挥了更多作用。3.益气活血药可以通过降低PDGF-B的表达,上调PDGF-A的表达,并减少两个PDGFRs的表达,以降低下游关键信号分子ERK1/2的激活,从而发挥抗纤维化和保护心脏的作用。