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目的:构建含有不同比例apoA-Iwt半胱氨酸突变体及apoA-V的重组脂质体,以研究apoA-I半胱氨酸突变体与apoA-V协同体外的抗动脉粥样硬化作用。方法:1.从温度、IPTG诱导浓度、IPTG诱导时间三个方面优化apoA-I大肠杆菌原核培养系统;2.将大肠杆菌原核系统培养纯化的重组高密度脂蛋白(recombinant high-density lipoprotein,rHDL):野生型载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I wild type,apoA-Iwt)、apoA-Iwt天然半胱氨酸突变体A-I Milano(apolipoprotein A-I Milano,apoA-IM)以及由apoA-Iwt构建的半胱氨酸突变体A-I(N74C)(apolipoprotein A-I(N74C),apoAI(N74C)),按1:0、100:1、1:1、1:100及0:1的实验比例加入载脂蛋白A-V(apolipoprotein A-V,apoA-V),按1:3.35的质量比加入二棕榈酰磷脂酰胆碱(1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine,DPPC),通过胆酸盐透析法分别构建含有不同比例apoA-Iwt半胱氨酸与apoA-V的重组高密度脂蛋白脂质体;3.通过二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DMPC)浊度澄清实验分析不同比例apoA-Iwt、apoA-IM、apoAI(N74C)与apoA-V混合rHDL的脂质结合能力;4.体外抗低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)氧化实验:利用体外铜离子介导的LDL氧化系统和硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)比色法分析检测不同比例apoA-Iwt半胱氨酸与apoA-V构建的rHDL脂质体的体外抗LDL氧化能力;5.细胞内脂质累积实验:利用THP-1来源的巨噬细胞分析不同比例apoA-Iwt半胱氨酸与apoA-V构建的rHDL脂质体对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)的巨噬细胞吸收和细胞内脂质累积的影响,油红O特异性染色脂质,Image Proplus测定细胞内油红O染色面积,并用总胆固醇(total cholesterol,TC)比色法测试盒测定细胞内的TC含量来验证油红O染色面积实验结果。结果:1.SDS-PAGE(12%)结果显示apoA-Iwt大肠杆菌原核培养系统最佳条件:温度为37℃,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,时间为3 h。成功用大肠杆菌原核培养系统表达纯化所需目的蛋白,分子量为28 KD。2.胆酸钠透析法构建了13个rHDL脂质体:apoA-Iwt-rHDL、apoA-IM-rHDL、apoA-I(N74C)-rHDL、apoA-V-rHDL、apoA-Iwt:apoA-V(100:1)-rHDL、apoA-IM:apoAV(100:1)-rHDL、apoA-I(N74C):apoA-V(100:1)-rHDL、apoAIwt:apoA-V(1:1)-rHDL、apoA-IM:apoA-V(1:1)-rHDL、apoA-I(N74C):apoA-V(1:1)-rHDL、apoA-Iwt:apoAV(1:100)-rHDL、apoA-IM:apoA-V(1:100)-rHDL和apoA-I(N74C):apoA-V(100:1)-rHDL。3.DMPC浊度澄清实验结果显示:与Negative组相比,实验组DMPC的浊度明显下降;apoA-V浊度清除率最强(P<0.05 vs apoAI-rHDL),随着混合rHDL中apoAV的比例增大,k值逐渐增大,浊度清除率增加,脂质结合能力逐渐增强。4.体外抗LDL氧化实验结果显示实验组的氧化产物MDA产生明显减少(P<0.05 vs Normal组),apoA-V抗氧化能力比apoA-Iwt、apoA-IM和apoA-I(N74C)强;rHDL脂质体中apoA-V含量增加,MDA量减少,抗氧化能力增强。5.细胞内脂质累积实验中结果显示实验组细胞内脂质的累积量明显降低(P<0.05 vs Normal组),apoA-Iwt、apoA-IM和apoA-I(N74C)显著抑制脂质累积,其中apoA-IM作用最强。总胆固醇比色法测定TC含量结果与油红O染色结果一致。结论:apoA-Iwt大肠杆菌原核培养系统最佳条件为温度为37℃,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,时间为3 h;大肠杆菌原核表达和纯化apoA-Iwt/apoA-IM/apoAI(N74C),纯化后的蛋白分子量为28 KD。apoA-Iwt半胱氨酸突变体与apoA-V的协同改善了改善脂质结合能力、抑制细胞内脂质累积、提高抗氧化能力,提示apoA-I半胱氨酸突变体与apoA-V协同抗动脉粥样硬化作用。