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原发性肝癌(hepatacellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)在全球恶性肿瘤发病率中占第5位。我国是肝癌大国,占死亡疾病谱第二位,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在多种恶性肿瘤(包括肝癌)过度表达,目前认为是肝癌转移的主要基因之一, OPN可能是临床检测肝癌术后复发转移的有价值指标之一。本课题先研究OPN在HCC的表达,接着研究RNA干扰对肝癌侵袭潜能的抑制作用。第一部分原发性肝细胞癌患者中OPN的表达及意义研究目的:探讨HCC组织中OPN的表达及其与临床指标的关系。方法:应用实时荧光定量PCR检测21例HCC患者肝癌组织、癌旁组织的OPN mRNA表达,应用免疫组化方法检测肝癌组织和癌旁组织的OPN蛋白表达,探讨OPN基因mRNA及蛋白表达水平及其与临床的关系。结果:HCC患者肿瘤组织、癌旁组织OPN的mRNA荧光定量PCR△CT值分别为(△CT值上升说明OPN mRNA表达下调):3.43±1.65;5.42±2.04;5.45±1.52(P<0.05),肝癌组织的△CT值比癌旁组织低,提示肿瘤组织OPN的mRNA表达高于癌旁组织。OPN蛋白评分在肿瘤组织和癌旁组织分别为:1.87±0.71;0.74±0.443(P<0.01),肿瘤组织的表达显著高于癌旁组织。OPN mRNA及蛋白质水平与HCC肿瘤大小、数目、肿瘤局部转移、生物学恶性程度等临床病理因素正相关(P<0.05);OPN mRNA表达和远处转移差异没有显著性(P>0.05),而和蛋白质水平表达的有显著性差异(P<0.05);OPN mRNA及蛋白水平与血清AFP、CEA、CA-199、γ-GT、ALP水平及伴肝硬化没有显著性差异(P>0.05)。结论:1.OPN mRNA和蛋白质在HCC中呈高表达。2.OPN mRNA水平及蛋白水与肝癌的临床的一些重要病理因素正相关。第二部分骨桥蛋白在不同肝癌细胞株的表达及其与侵袭潜能的关系目的:研究不同转移潜能人肝癌细胞株的OPN表达情况及OPN浓度与与细胞侵袭潜能的关系。方法:应用半定量PCR、Westerm Blot方法检测不同转移潜能人肝癌细胞株(BLE 7402、SMMC-7721、HEP-G2等)OPN mRNA和蛋白的表达情况,观察上述肝癌细胞株在不同OPN培养浓度下的生存曲线、细胞周期、FN粘附能力、侵袭能力。结果:HEP-G2、BLE 7402、SMMC-7721三种肝癌细胞株OPN mRNA的△CT值分别为:11.31,14.78,15.88;蛋白表达分别为:1.00,0.48,0.36。OPN mRNA和蛋白表达水平和肝癌细胞侵袭能力(包括生长能力、粘附能力、细胞侵袭转移能力等)呈正性相关(P<0.05)(侵袭能力:HEP-G2> BLE7402> SMMC-7721)。结论:OPN能促进肝癌细胞株的侵袭潜能。第三部分应用RNA干扰肝癌细胞株骨桥蛋白表达对其侵袭潜能的影响目的:观察RNA干扰技术是否能抑制人肝癌细胞株内骨桥蛋白(OPN)的表达,及其细胞侵袭潜能的影响。方法:在第二部分实验基础上,应用化学合成OPN序列特异性双链RNA(OPNi-1),转染人肝癌细胞株,用荧光定量PCR和Western Blot比较三种不同转移潜能的人肝癌细胞株(BLE 7402、SMMC-7721、HEP-G2)RNA干扰前后OPN的mRNA和蛋白表达情况。应用生存曲线、FN粘附和侵袭转移实验等检测RNA干扰后的肝癌细胞株侵袭能力RNA干扰前后的变化。结果:RNA干扰后HEP-G2、BLE 7402、SMMC-7721细胞株OPN mRNA的△C T值分别从原来(第二部分实验)的11.31,14.78,15.88显著上升达12.37,16.80,17.68 (P<0.05)(提示OPN mRNA表达显著下降);OPN蛋白表达从原来的1.00,0.48,0.36显著下降达0.60,0.36,0.26 (P<0.05),相当于OPN的mRNA表达平均降低79%,蛋白表达下降81%。RNA干扰抑制三种肝癌细胞株的侵袭能力(包括生长曲线、细胞周期、粘附能力和细胞侵袭转移能力等)。结论:RNA干扰通过抑制人肝癌细胞株内0PN基因而抑制其侵袭能力