论文部分内容阅读
目的：探讨慢病毒介导shRNA沉默Yes-相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)基因对人前列腺癌细胞株LNC aP细胞增殖、凋亡及其雄激素受体(androgen receptor, AR)的影响。方法：3条针对YAP基因的shRNA (YAP-shRNA1、YAR-shRNA2、 YAP-shRNA3)慢病毒干扰载体感染LNCaP细胞,嘌呤霉素筛选7天以上,建立慢病毒稳定感染细胞系；利用实时荧光定量PCR不口Western blot技术分别检测细胞YAP. ARmRNA和蛋白表达;选取沉默效率最高YAP-shRNA1慢病毒干扰载体组；以细胞增殖/毒性检测(cellcounting kit-8, CCK-8)、平板克隆形成实验(colony formation)测定LNCaP细胞增殖能力；Hoechst 33258染色法对细胞凋亡形态改变进行检测；流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞周期分布和凋亡改变,Western blot技术检测细胞周期调控因子p21、CyclinDl和凋亡调控因子Bcl-2、Bax表达。结果：重组慢病毒成功感染前列腺癌LNCaP细胞,通过嘌呤霉素筛选7天后,感染效率达95%以上,获得稳定沉默YAP基因LNCaP细胞系。与空白对照组及阴性对照组比较,感染shF NA慢病毒干扰载体各组中AR mRNA及蛋白表达水平显著下调,细胞增殖受到明显抑制,细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡显著增加,且细胞周期调控蛋白p21、促凋亡蛋白Bax表达上调,细胞周期调控蛋白CyclinD1、抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调。结论：慢病毒介导shRNA沉默YAP基因能有效下调YAP在LNCaP细胞中表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,作用机制可能是通过调控p21和CyclinD1使细胞周期阻滞,影响Bcl-2和Bax表达而诱导细胞凋亡；YAP可能作为AR配体参与AR信号通路的调节。